CONJUGACION OCTUBRE 2013

1. CONJUGACION OCTUBRE 2013

2. Conjugación. Un poco de historia • La evolución biológica está basada en: la variación genotípica de los individuos, y la selección que favorece a esos individuos y que les permite prosperar como una nueva especie, o competir y desplazar al organismo precursor.

3. Conjugación • Cuando Darwin bosquejó estos principios básicos, los conocimientos de genética eran aun muy escasos (Mendel acababa de describir los fundamentos de la herencia apenas unos años antes).

4. Conjugación • Cuando empezamos a entender las bases moleculares de la biología, las mutaciones se concibieron como la única fuente de variación para los organismos que se reproducen asexualmente, como las bacterias

6. La definición del papel de las mutaciones en la variación biológica empezó con el trabajo de de Vries en plantas, alrededor de 1900, y se hizo extensiva a las bacterias gracias a Beijerinck, ese mismo año.

7. Conjugación • Tomó casi 30 años más el descubrimiento de una nueva y extraña forma de variación, la transformación de neumococos avirulentos en virulentos. • Y otros 16 años para que Avery, MacLeod y McCarty, tomando el trabajo pionero de Griffith, descubrieran, de paso, la función del DNA.

8. En 1953, Lederberg y Cavalli, y Hayes por su cuenta, hallaron el primer plásmido conjugativo, el "Factor F".

9. Conjugación • Lentamente, empezamos a identificar otras fuentes de variación en las bacterias, especialmente aquellas derivadas de la transferencia horizontal de genes.

10. Transmisión de Material Genético

11. Transformación • Una célula bacteriana toma DNA del ambiente y lo incorpora. • De manera natural en Gram +.

12. Transducción • Involucra presencia de fagos, los cuáles transfieren el DNA de la célula donadora a la célula receptora, la cual puede incorporarlo a su cromosoma. • Ciclo Lítico.

13. Conjugación • Una célula bacteriana transfiere DNA a otra célula bacteriana, por contacto directo célula a célula. • DNA transferido: Parte del genoma ó un plásmido.

14. Descubrimiento de la conjugación

15. Necesidad de contacto directo entre células

16. ESTRUCTURA DE LOS PLÁSMIDOS.- Son típicamente moléculas de DNA circular de doble cadena de un tamaño que va de 2 a 100KB. Estos plásmidos están superenrrollados dentro de la célula. • REPLICACIÓN DE PLÁSMIDOS.- Son capaces de replicarse independientemente del cromosoma del huésped. Tienen un origen de replicación ( Ori R). Dos modos de replicación: Replicación teta y replicación por círculo rodante. La replicación es central para controlar un número importante de propiedades de los plásmidos: Rango de huéspedes; número de copias; incompatibilidad y movilidad.

17. PROPIEDADES DE PLASMIDOS • RANGO DE HUÉSPEDES: Si están limitados a un número limitado de bacterias, se les llama de RANGO ESTRECHO. Si son capaces de replicarse en un amplio rango de especies bacterianas, se llaman de AMPLIO RANGO. CONTROL DEL NÚMERO DE COPIAS DE PLÁSMIDO: Puede variar de 1 ( plásmido F) a algunos cientos (pUC18). El número es una propiedad de cada plásmido y depende del mecanismo por el cual se regula su propia replicación.

18. PROPIEDADES DE PLÁSMIDOS • GRUPOS DE INCOMPATIBILIDAD: Si una célula contiene dos plásmidos diferentes y cada uno tiene el mismo mecanismo de control de la replicación, cada uno sería capaz de controlar la replicación del otro. Como consecuencia uno de los dos plásmidos eventualmente se pierde de la célula como resultado de la división celular. • En este caso los dos plásmidos serían incompatibles. • Cuando los plásmidos tienen diferentes mecanismos de control, se replican independientemente uno de otro y durante la división celular cada célula hija recibe una copia.

19. PROPIEDADES DE PLÁSMIDOS • TRANSFERENCIA DE PLÁSMIDOS: Algunos plásmidos se pueden transferir entre bacterias a través de la conjugación bacteriana. Estos plásmidos codifican para todas las proteínas y funciones que se requieren para movilizar y transferir de una célula huésped a una célula recipiente. • Muchos plásmidos son incapaces de hacer esto.

20. Ejemplo de plásmido

21. FACTOR F ( FERTILIDAD)

22. Conjugación • El pelo sexual F es un cilindro hueco de aproximadamente 20 µm de largo, 8 nm de diámetro externo y 2 nm de diámetro interno, que es lo suficientemente grande para el pasaje de una molécula de DNA simple cadena. Este pelo está formado por un única subunidad proteica denominada pilina que se encuentra codificada por el gen traA.

23. Conjugación • El apareamiento efectivo entre dos células donantes es impedido por la exclusión de las superficies, la que requiere de los productos de los genes traS y traT localizados en la membrana citoplasmática y en la membrana externa, respectivamente. • la transferencia de DNA ocurre después del apareamiento célula-célula que es estabilizado por los productos de los genes traG y traN.

24. Conjugación • El Factor F es transferido de la célula donante hacia la célula receptora en forma de simple cadena lineal con el extremo 5' . • El nickeado (rotura) de una de las cadenas del Factor F. Este Factor es nickeado en el oriT por el producto del gen traI, y que se mantiene unido al extremo 5' de la cadena cortada. • La proteína TraI, que junto al producto del gen traY tiene actividad de endonucleasa, posee actividad actividad de helicasa y ATPasa, y separa la cadena de DNA conjugante durante la translocación utilizando ATP. • el DNA simple cadena es protegido durante la transferencia por las proteínas SSB (Single Strand-Binding Proteins) tanto en la célula donante como en la célula receptora.

25. Conjugación • La transferencia del extremo 5' es acompañada por la síntesis continua de la cadena de DNA complementaria en la célula donante. Mientras que en la célula receptora, el DNA simple cadena transferido sirve como templado para la síntesis discontinua de la cadena complementaria.

26. Conjugación Las células pueden denominarse de diversas maneras en relación al estado en que se encuentra el Factor F dentro de ellas: • Células F-: Estas células no contienen al Factor F y no transfieren ni genes F ni genes bacterianos. Son eficientes células receptoras durante la conjugación. • Células F+: Estas células contienen al Factor F en el citoplasma. Conjugación. La transferencia de genes cromosomales ocurre con una muy baja frecuencia cuando el Factor F se encuentra en este estado. • Células Hfr: Son células que contienen al Factor F integrado al cromosoma. Pueden transferir marcadores cromosomales con alta eficiencia desde un punto fijo del cromosoma, generando un gradiente de transferencia de marcadores. • Células F': Son células que tienen en el citoplasma al Factor F asociado con ciertos segmentos del cromosoma bacteriano. Pueden transferir al Factor F y a los segmentos asociados del cromosoma con alta eficiencia, y pueden mediar la transferencia de genes cromosomales por su integración en regiones homólogas del cromosoma.

27. Conjugación: Gram -

28. Conjugación: Gram - • F+ y F-: Ambas células se vuelven F+ CONJUGACIÓN

29. Conjugación: Gram - • F+ y F+: Se inhiben por contacto CONJUGACIÓN

30. Conjugación: Gram - • Hfr (alta frecuencia de recombinación): el plásmido se integra al cromosoma bacteriano. Sigue siendo donadora.

31. Conjugación: Gram - • Hfr y F-: no se transfiere el cromosoma completo, la parte del plásmido F se escinde.

32. Conjugación: Gram - • F’: Se escinde el plásmido F y se lleva consigo una parte del cromosoma. plásmido F’, donador.

33. Conjugación: Gram - • F’ y F-: Se generan células diploides parciales , la receptora se llama merocigoto. CONJUGACIÓN

34. Conjugación Gram + • Similar a lo que ocurre con Gram -. • Sistema Mpf, es más simple. • E. faecalis secretan péptidos parecidos a feromonas que estimulan la expresión de genes traen las bacterias vecinas.

35. Conjugación ¿Para qué? ¿Cómo seleccionamos? Genes marcadores, dentro del plásmido y permite seleccionar colonias conjugantes por fenotipos:auxotrofías, fuente de energía, resistencia/susceptibilidad a antibióticos • Resistencia: antibióticos, metales pesados • Colicinas y Bacteriocinas: proteínas con actividad antimicriobiana. • Factores de virulencia: Toxinas. • Actividades metabólicas: Síntesis ó degradación de compuestos carbonados

36. En la práctica… E. coli JM1452StrR Resistente a Estreptomicina. No codifica para el pili (genes tra), por lo tanto es... E. coli W3110/F´KmTn3 Resistente a la Kanamicina. Cepa F’, por lo tanto es… RECEPTORA DONADORA

37. En la práctica… 600 µL 300 µL 120 µL Resistente a Estreptomicina Resistente a Kanamicina

38. En la práctica…

39. Eficiencia de conjugación #CT: Número de Colonias Transconjugantes #CP: Número de Colonias Parchadas