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UPC II – Microbiologia

UPC II – Microbiologia. Aula prática 9. 2012/2013. Maria José Correia 26/11/2012. Sumário P9:. Identificação de Streptococcus por PCR Pesquisa de um gene como marcador filogenético Preparação da suspensão celular bacteriana através de lise por fervura

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Presentation Transcript

  1. UPC II – Microbiologia Aula prática 9 2012/2013 Maria José Correia 26/11/2012

  2. Sumário P9: • Identificação de Streptococcus por PCR • Pesquisa de um gene como marcador filogenético • Preparação da suspensão celular bacteriana através de lise por fervura • Amplificação do fragmento de DNA por PCR UPC II - Microbiologia 2012/2013

  3. Identificação de bactérias • Métodos clássicos fenotípicos: bioquímicos, imunológicos avaliação de resistência (morosos). • Métodos moleculares genotípicos: métodos baseados em PCR e variantes: RAPD-PCR, rep-PCR, ARDRA, multiplex PCR. • Filogenia • análise da sequência 16S rRNA • Genes “housekeeping” • -universais • -conservação estrutural e funcional • Marcadores genéticos (específicos de um microrganismo) UPC II - Microbiologia 2011/2012 UPC II - Microbiologia 2012/2013

  4. Streptococcus mutans • Patogénico maioritário associado a cáries dentárias (crianças) • Processo rápido, específico e sensível para diagnóstico: • PCR – primers específicos para identificação • (Sequência alvo: região intergénica localizada entre o fim e o início do cromossomal circular) • Sm479F: 5 -TCGCGAAAAAGATAAACAAACA-3 • Sm479R: 5 -GCCCCTTCACAGTTGGTTAG-3 • permitem identificar a presença de S. mutants UPC II - Microbiologia 2011/2012 UPC II - Microbiologia 2012/2013 4

  5. PCR • Desnaturação da cadeia dupla de DNA • Hibridação com primers específicos (iniciadores da reacção) • Extensão do fragmento • DNA polimerase • dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) • http://www.maxanim.com/genetics/PCR/pcr.swf UPC II - Microbiologia 2011/2012 UPC II - Microbiologia 2012/2013

  6. Reacção de PCR UPC II - Microbiologia 2011/2012 UPC II - Microbiologia 2012/2013 6

  7. Reação de PCR UPC II - Microbiologia 2011/2012 UPC II - Microbiologia 2012/2013 7

  8. Trabalho a realizar • Preparação de suspensão celular (lisado), que serve como DNA molde da reacção de PCR. • Pipetar 10l de meio de cultura para um microtubo. • Centrifugar 10minutos à Vmáx. • Pipetar o meio e substituir por água esteril. • Ferver 10minutos, • Centrifugar 10minutos à Vmáx. • Preparar a reação de PCR em gelo • Iniciar amplificação no termociclador. UPC II - Microbiologia 2011/2012 UPC II - Microbiologia 2012/2013 8

  9. Trabalho a realizar • Preparar reação de PCR • Isolado e amostra de DNA (controlo) • Primers para S. mutans UPC II - Microbiologia 2011/2012 UPC II - Microbiologia 2012/2013

  10. Preparação da reacção de PCR UPC II - Microbiologia 2011/2012 UPC II - Microbiologia 2012/2013

  11. Programa de amplificação UPC II - Microbiologia 2011/2012 UPC II - Microbiologia 2012/2013

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