Aplicaciones Biol ógicas de la Espectrometría de Masa

1. AplicacionesBiológicas de la Espectrometría de Masa Matías Möller

2. Espectrometría de masa MS/MS Espectrometría en Tándem: Secuenciación de péptidos

3. Espectrometría de masa MS/MS: Espectrometría en Tándem Seleccionar uno de los iones de la muestra, fragmentarlo y estudiar la formación de iones “hijos” mp+ md+ + mn0 Aplicaciones: Identificación de moléculas Secuenciación de péptidos “al vuelo” Modificaciones posttraduccionales

4. Espectrometría de masa MS/MS: Espectrometría en Tandem ESI-Q Q1Q2Q3: Triple Cuadrupolo. Q1 y Q3 separan iones moleculares, mientras Q2 sirve de cámara de colisión: Se introduce un gas para que los iones acelerados choquen y se fragmenten CID: CollisionInducedDissociation Se usa mucho para realizar cuantificaciones por LC-MS-MS

5. peptides peptides + + + + + + + + Mass Analysis Ionization protein Digestion MS m/z

6. peptide fragments protein peptides ++ + + + ++ ++ + + + + + + + + ++ + Mass Analysis Digestion Ionization Isolation Fragmentation Isolation MS MS/MS m/z m/z m/z

7. Analyse Parent Masses Tandem en el espacio MS MS/MS Analyse Fragment Masses Fragment Select Parent

8. 1 péptido seleccionado para MS/MS + + MS/MS + + + + MS/MS Secuenciaciónpeptídica Mezcla de péptidos Espectro MS/MS: masa de los fragmentos Espectro MS Carlos Cerveñansky

9. MS/MS: Espectrometría en Tandem ESI-IT IT: Trampa de Iones La trampa de iones puede analizar los iones de una muestra  MS También puede seleccionar uno, y concentrarlo en la trampa Luego se introduce Helio para que los iones acelerados choquen y se fragmenten Luego se analizan los iones hijo CID: CollisionInducedDissociation Las trampas de iones tienen capacidad de hacer MSn se seleccionan iones hijo  se fragmentan, analizan, seleccionan uno  fragmentan, analizan, seleccionan uno  hasta que les de la sensibilidad MS2

10. Tandem en el tiempo Fragment 426.7 Isolate Parent Ion Intact ions Intact ion This analysis/isolation/fragmentation can be carried out in an ion trap Daughters

11. Espectrometría de masa MS/MS: Espectrometría en Tandem MALDI-TOF Iones moleculares que se fragmentan durante el vuelo llegan juntos al “reflector” y pueden ser analizados por el mismo. PSD: Post SourceDecay

12. Linear Extraction plate Reflector detector grids detector Timed ion selector Reflector Laser Beam guide Camera Pumping Pumping ESQUEMA:Instrumento de tecnología MALDI-TOF

13. C-terminal N-terminal

14. b ions y ions b1 b2 b3 b4 y4 y3 y2 y1 http://db.systemsbiology.net:8080/proteomicsToolkit/FragIonServlet.html

15. + + + + F L G K F L G K + + b3 y1 F L G K + + + + CID F L G K F L G K b2 y2 + F L G K + + + + F L G K F L G K b1 y3 y1 y3 b1 y2 b3 b2 Relative Intensity K G L F K F L G m/z

16. y13 y12 y11 y10 y9 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 y1 b1 b2 b3 b4 b5 b6 b7 b8 b9 b10 b11 b12 b13 Peptide Fragmentation by MS/MS y9 887.6 100 y10 90 986.6 80 y8 70 y12 774.5 b5 Relative Abundance 60 y12* 1186.7 494.3 y11 b6 y13 1168.7 50 1085.7 y7 1243.7 607.4 40 673.5 b4 b11 b12 b8 30 395.2 b5* 1006.6 b6* 1119.6 b7 b13 779.5 476.3 20 772.5 885.6 589.3 a12 708.4 a5 984.6 1184.7 b10 466.3 10 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 m/z His-Gly-Thr-Val-Val-Leu-Thr-Ala-Leu-Gly-Gly-Ile -Leu-Lys

19. Espectrometría de masa MS/MS: Espectrometría en Tandem Fragmentación peptídica

22. Identificación de proteínas Peptidemassfingerprinting y proteomica

23. Identificación de proteínas

24. Mapeopeptídicopor EM(Peptide Mass Fingerprinting/MS) péptidos proteínaintacta enzimaproteolítica MEMEKEFEQIDKSGSWAAIYQDIRHEASDFPCRVAKLPKNKNRNRYRDVS PFDHSRIKLHQEDNDYINASLIKMEEAQRSYILTQGPLPNTCGHFWEMVW EQKSRGVVMLNRVMEKGSLKCAQYWPQKEEKEMIFEDTNLKLTLISEDIK SYYTVRQLELENLTTQETREILHFHYTTWPDFGVPESPASFLNFLFKVRE SGSLSPEHGPVVVHCSAGIGRSGTFCLADTCLLLMDKRKDPSSVDIKKVL LEMRKFRMGLIQTADQLRFSYLAVIEGAKFIMGDSSVQDQWKELSHEDLE PPPEHIPPPPRPPKRILEPHNGKCREFFPNHQWVKEETQEDKDCPIKEEK GSPLNAAPYGIESMSQDTEVRSRVVGGSLRGAQAASPAKGEPSLPEKDED HALSYWKPFLVNMCVATVLTAGAYLCYRFLFNSNT

25. Voyager Spec #1=>BC=>NF0.9[BP = 12364.9, 60367] 12366.46 6.0E+4 100 90 80 6187.17 70 12583.58 60 50 % Intensity 12326.17 40 30 6292.68 20 12784.48 10 0 0 5000 7000 9000 11000 13000 15000 Mass (m/z) Espectro de masa del citocromo c de caballo A. Molécula entera. Matriz: ácido sinapínico

26. Voyager Spec #1=>MC=>BC[BP = 1633.6, 19883] 2.0E+4 163 3 . 8 2 100 1168.61 90 80 70 60 % Intensity 50 1190.54 40 1212.53 1433.76 30 1655.59 1170.18 1213.53 20 1296.68 1152.36 1046.18 1631.62 1350.70 1478.82 1124.52 1230.50 10 0 0 1000 1160 1320 1480 1640 1800 Mass (m/z) B. Molécula digerida con tripsina. Matriz: ácido -ciano hidroxicinámico

27. Nivelesde información……… en la caracterización de proteínaspor MS. • medida de masa de una molécula entera 1 valor experimental • medidas de masas en mapeo peptídico5-20 valores experimentales • secuenciado de péptidos por MS/MS más de 100 valores experimentales …mejora en cantidad y calidad de la información

28. Peptide fragmentation fingerprinting PFF = ion search MS/MS database matching Protein(s) Peptides Ions peaklists MS/MS spectra of peptides Enzymatic digestion 340.695086 676.96063 498.8283 545.564 1171.967066 261.107346 342.51458 456.727405 363.268365 Result: ranked list of peptide and protein candidates Match In-silico fragmentation • MAIILAG • MAIILA • MAIIL • MAII • MAI • M • M • AIILAG …MAIILAGGHSVRFGPKAFAEVNGETFYSRVITLESTNMFNEIIISTNAQLATQFKYPNVVIDDENHNDKGPLAGIYTIMKQHPEEELFFVVSVDTPMITGKAVSTLYQFLV … In-silico digestion - MAIILAGGHSVR - FGPK - AFAEVNGETFYSR - VITLESTNMFNEIIIK - YPNVVIDDENNDK … 361.107346 338.695086 676.96063 498.8283 1045.564 1171.967066 342.51458 457.827405 263.268453 Theoretical fragmented peptides Sequence database entry Theoretical proteolytic peptides Theoretical peaklist

30. Proteoma • Producto final del genoma másvariedad • Es unaentidaddinámica Fenotipo • Modificacionesposttraduccionales • No todos los genes se expresan como proteínas en todos los estadios/tipos celulares

31. 1 gen = 1proteina? • 1 gen ya no equivale a unaproteina • La definición de gen esdebatible(ORF, promotor, pseudogen, producto de gen, etc) • 1 gen=cuántasproteinas?(no sabemos)

32. Sujetos de estudio de la Proteómica • Identificación de Proteínas (pept mass fingerprint) • Comparación de niveles de expresión de Proteinas • Función de Proteinas • Modificacionesposttraduccionales de Proteinas • Localización y Compartimentalización de Proteinas • InteraccionesProteina-Proteina

35. Quantitativeproteomics

36. Quantitativeproteomics

38. Identificación de sitios de modificaciónOxidación de citocromo c Located in mitochondria, plays an important role in apoptosis intrinsic pathway and has been linked to oxidative stress responses Y74 Y74 Y67 Y67 Y48 Y48 Y97 Y97

39. aPLPC TOCL [H2O2] 37°C,1 Hr

40. b6 y4 Y+16 y12 y11y10y9y8y7y6y5y4y3y2y1 T---E---R---E---D---L---I---A---Y*--L---K---K b1 b2 b3b4b5b6b7b8b9b10b11 b12 y5 b7-CO (2+) y7 (2+) b5 y6 (2+) b7 y5 (2+) b8 b10 y9

41. GAPDH Reactionwith Nitro-oleicacid BatthyanyJ.Biol.Chem. 2006, p.20450

42. MS-Imaging

43. MS-Imaging

47. Mass is given as m/z which is the mass of the ion divided by its charge • Monoisotopic mass is the mass of an ion for a given empirical formula calculated using the exact mass of the most abundant isotope of each element (C=12.00000, H=1.007825 etc) • Average mass is the mass of an ion for a given empirical formula calculated using the average exact mass for each element (C=12.01115, H=1.00797 etc) • Nominal mass is the mass of an ion for a given empirical formula calculated using the integer mass of the most abundant isotope for each element (C=12, H=1 etc)

49. Electrospray Ionisation and Charge [M+2H]2 + 674.7 100 Substance P % [M+H] + 685.7 693.6 666.1 600.4 1347.7 462.8 0 Da/e 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300

50. Determining Charge State 100 95 90 524.3 85 80 75 70 65 60 55 Relative Abundance 50 45 40 35 30 525.3 25 20 15 10 526.2 5 0 520 521 522 523 524 525 526 527 528 529