Praktické aspekty forenzní DNA diagnostiky

1. Praktické aspekty forenzní DNA diagnostiky RNDr. Jiří Fišer 19. dubna 2011 Olomouc

2. DNA PROFIL DNA profil v grafické podobě DNA profil v podobě alfanumerického znaku

3. Návaznost kroků během analýzy DNA v laboratoři DNA profil PCR a anylýza produktů Koncetrace DNA (fakultativní krok) Kvantifikace DNA v izolátu(fakultativní krok) Izolace DNA Určení typu biologického materiálu (fakultativní krok) Vzorek

4. Rozdělení forenzních vzorků • STOPY vznikly v souvislosti s prověřovanou skutečností, jsou neopakovatelné a jsou vlastním předmětem našeho zkoumání • POROVNÁVACÍ VZORKY zajišťovány až následně dle potřeby, případně i opakovaně a slouží k identifikaci stopy resp. jejího původce

5. Forenzní stopy (biologické) – obecná definice • Kriminalistickou stopou jsou všechny následky vzájemné interakce mezi sledovaným objektem a jeho okolím, zanechané jak na prostředí, tak i na sledovaném objektu. • Interakce (odraz, stopa) musí být v souvislosti se sledovanou (kriminalisticky relevantní) událostí. Odraz (stopa) musí existovat alespoň od svého vzniku do zjištění a musí být vyhodnotitelná současnými forenzními metodami a prostředky. • Biologické stopy se řadí mezi stopy materiální, vznikající na nejrůznějších objektech neživé nebo živé přírody. • Biologické stopy mívají velmi často latentní charakter. • Biologické stopy se velmi často vyskytují v korelaci se stopami jiného typu. • Biologickým materiálem pro forenzní účely se rozumí krev, sliny, sperma, trichologický a jiný materiál lidského, případně i živočišného a rostlinného původu.

6. Forenzní vzorky a stopy (biologické) - příklady • Příklady typů zpracovávaných stop: • krevní skvrny • sliny (tj. nedopalky, dopisní obálky, žvýkačky, kukly, sklenice, slánky … • sperma • vlasy a chlupy se zachovaným kořínkem (vytržené) • nečistoty z pod nehtů • měkké a tvrdé tkáně (svalovina, kosti …) • stěry z povrchu různých předmětů (intenzívně používané nástroje, obuv a oděvy, ovládací prvky vozidel apod.). • Příklady typů srovnávacích vzorků: • krev • bukální výtěr • jiný typ biologického materiálu (svalovina, kosti, zubní kartáček, hřeben, oděvy, holící strojek…)

7. Porovnávací vzorky – DNA analýzy Vhodný je jakýkoliv materiál, ze kterého lze izolovat DNA • Krev (pro laboratoř nejvýhodnější typ materiálu a proto původně preferovaná) • Sliny (nejvýhodnější z hlediska zajišťování, i proto je v současnosti preferovaným typem porovnávacího vzorku) • Trichologický materiál (vlasy) (pouze materiál s vytrženým kořínkem, zajišťován spíše výjimečně) • Kosti (krajní varianta, zpravidla v případě, kdy je vzorek odebírán mrtvolám v pokročilém stupni rozkladu)

8. Porovnávací vzorky – DNA analýzy • Krev byla původně preferovaným materiálem • Výhodná z hlediska izolace • Nevýhodou jsou problémy s odběrem, transportem a skladováním • Toto částečně řeší přechod od tekuté krve ve zkumavce k tzv. FTA kartám.

9. Porovnávací vzorky – DNA analýzy • Nově preferovaným materiálem • Výhodné především z hlediska odběru • Další výhody s transportem a skladováním • Nevýhodou je pro laboratoř problematicky odhad množství DNA ve vzorku (vhodná je kvantifikace).

10. Forenzní stopy • Množství materiálu je limitováno. • Problém analýzy latentních stop. • Kvalita materiálu je neznámá. • Častý výskyt tzv. smíšených stop. • Nutnost zohlednit nároky jiných forenzních disciplín. • Nutnost zohlednit, případně upřednostnit i jiné okolnosti, pro obajsnění případu významnější a požadavky zadavatele. • Nutnost vyžádat si, je-li to možné odpovídající typ porovnávacích vzorků.

11. Forenzní stopy – místa výskytu • Předměty zaslané rovnou do laboratoře - Dostatek času a „laboratorní zázemí“ - Ideální podmínky při vyhledávání a detekci stop

12. Forenzní stopy – místa výskytu • Interiéry mimo laboratoř (byty, kanceláře, garáže, sklady, výrobní prostory atd.) - Podmínky ztíženy, nelze využít všechny dostupné metodiky při průkazech - Výhodou je možnost posoudit původní stav stop

13. Forenzní stopy – místa výskytu • Exteriéry, vozidla - Podmínky opět ztíženy, nelze využít všechny dostupné metodiky při průkazech - Často i časová nouze (teplota, déšť, tma) - Často jsou proto zajišťovány celé předměty s podezřením, že na jejich povrchu se mohou vyskytovat forenzní stopy - V případě potřeby možno odtáhnout, ohledat v garáži a využít „zázemí laboratoře“

14. Kvalita materiálu

15. Forenzní stopy - množství materiálu

16. Množství materiálu – mikroskopický preparát

17. Latentní stopy • Pouhým okem nezjistitelné • Může se tedy jednat o jakýkoliv předmět na jehož povrchu lze předpokládat přítomnost biologického materiálu • Může přinést zásadní informace, jindy policejním technikem zneužíváno ke splnění úkolů zajistit stopu za každou cenu

18. Nutnost zohlednit nároky jiných forenzních disciplín • Trasologie (otisky např. podešví bot nebo rukavic v krvi) • Daktyloskopie (často rovněž latentní stopy jejichž zviditelněním může dojít ke zničení stop biologických) • Chemie a mikrostopy (například materiál zajišťovaný z rukou a zpod nehtů osob)

19. Zohlednění jiných okolností • Biologické stopy jsou v tomto případě až druhotné, důležitější je, že jejich tvar a rozmístění vypovídá o tom, že místo nálezu oběti bylo i místem útoku. Svědčí i o jeho intenzitě.

20. Návaznost kroků během analýzy DNA v laboratoři DNA profil PCR a anylýza produktů Koncetrace DNA (fakultativní krok) Kvantifikace DNA v izolátu(fakultativní krok) Izolace DNA Určení typu biologického materiálu (fakultativní krok) Vzorek

21. Izolace DNA • Množství DNA pro analýzu 15 STR lokusů (stačí 250 pg - 10 ng, 6pg DNA v jedné buňce) • Délka analyzovaných STR úseků DNA je malá (od cca 80 bazí po maximálně 600 bazí) • Množství je ovšem limitováno! • Nestandardní, proměnlivé typy materiálu • Různá a často nezjistitelná kvalita materiálu • Možná přítomnost inhibitorů PCR reakce • Možná kontaminace materiálem (DNA) jiné osoby • Izolace pomoci Chelex-Resin • Miniizolace na speciálních kolonkách • FTA karty • Izolace pomocí organických chemikálií fenol- chloroform, apod.

22. Automatickýizolátor DNA Izolace DNA Promývací a lyzační pufry Mikrokolony k „vychytávání“ DNA Přístroje nutné k provedení izolace

23. FTA karta- alternativní varianta- snadné skladování a transport- pro některé typy vyšetření nevhodná

24. Detail laboratorního boxu Laminární box třídy II -ochrana vzorku a současně ochrana personálu

25. Návaznost kroků během analýzy DNA v laboratoři DNA profil PCR a anylýza produktů Koncetrace DNA (fakultativní krok) Kvantifikace DNA v izolátu(fakultativní krok) Izolace DNA Určení typu biologického materiálu (fakultativní krok) Vzorek

26. Kvantifikace DNA • ELFO na agarozovém gelu. • UV - spektrofometrie. • Fluorescenční značky a fluorometr. • RT-PCR se značenou specifickou sondou. (specifická, přesná, citlivá, vyžaduje malé množství materiálu)

27. Návaznost kroků během analýzy DNA v laboratoři DNA profil PCR a anylýza produktů Koncetrace DNA (fakultativní krok) Kvantifikace DNA v izolátu(fakultativní krok) Izolace DNA Určení typu biologického materiálu (fakultativní krok) Vzorek

28. Koncentrace roztoku DNA • Postupy na principu filtrace. • Volitelná denzita filtrační frity (používá se zpravidla 30 000 – 100 000) • Typ lze volit i dle koncentrovaného objemu

29. Návaznost kroků během analýzy DNA v laboratoři DNA profil PCR a anylýza produktů Koncetrace DNA (fakultativní krok) Kvantifikace DNA v izolátu(fakultativní krok) Izolace DNA Určení typu biologického materiálu (fakultativní krok) Vzorek

30. PCR PCR - polymerázová řetězová reakce In vitro enzymatické namnožení žádaného úseku DNA - Primery –oligonukleotidy, uměle syntetizované nukleotidové řetězce cca 15 - 30 bazí, vymezují analyzovanou oblast (mohou být značené fluorescenčními barvami) - enzym – Taq polymeráza, „připojuje“ na 3´ konec primeru, k matrici komplementární báze - nukleotidy dNTPs (deoxynukleosidtrifosfáty) - matrice – DNA - pufry pro zajištění optimálního prostředí

31. Sekvenátor

35. LADDER - žebřík

36. Modrá část ladderu

37. Návaznost kroků během analýzy DNA v laboratoři DNA profil PCR a anylýza produktů Koncetrace DNA (fakultativní krok) Kvantifikace DNA v izolátu(fakultativní krok) Izolace DNA Určení typu biologického materiálu (fakultativní krok) Vzorek

38. DNA PROFIL DNA profil v grafické podobě DNA profil v podobě alfanumerického znaku

39. Populační data Autor RNDr. Daniel Vaněk PhD. Data poskytovaná firmou PROMEGA

40. Kompatibilita výsledků zkoumání • CODIS a ENFSI nezávazná doporučení ohledně výběru STR polymorfismů • Poskytované výsledky jsou kompatibilní s výsledky všech policejních laboratoří • Existují pouze drobné rozdíly v rozsahu zkoumání • Kvalita výstupů je zaručená akreditací laboratoře • Výsledky jsou podávány v kvalitě a formě plně postačující pro porovnání s DNA profily uloženými v ND DNA a případně i pro uložení do ND DNA.

41. Analýza Y-chromozomu Založená na totožném principu jako klasická, základní analýza jaderné DNA • analýza vhodná pro smíšené vzorky, kdy je malé množství materiálu mužského původu „překryto“ výrazným přebytkem materiálu ženského původu (mravnostní delikty) • analyzujeme celkem 17 STR polymorfizmů lokalizovaných na Y chromozomu • tato sestava sedmnácti polymorfizmů obsahuje i všechny oblasti doporučované ENFSI • výhodou je možnost zjistit příbuzenské vazby po paternální línii (celá sestava alel se dědí z otce na syna, s výjimkou mutací, beze změn) • nemožnost takto analyzovat materiál ženského původu

42. Národní DNA databáze • Je provozována pouze Policií ČR • Založen na databázovém programu „CODIS“ • Obsahuje DNA profily v alfanumerické podobě • Nelze z něj zjistit žádné vlastnosti či zdravotní predispozice vyšetřované osoby • Součástí je i fyzická sbírka vzorků DNA • Uloženy pod tzv. „identifikátorem“ (informace o typu vzorku, pracovišti a pracovníkovi, roku zpracování a případu …) • Umožňuje rychlé a efektivní porovnávání • Některé statistické výpočty na základě aktuálních frekvencí výskytu jednotlivých alel • DNA profily stop, obžalovaných a odsouzených, pracovníků laboratoře a další eliminační vzorky • Umožňuje eliminovat „parciální chyby“ v analýze • Vkládání , vymazávání a úpravu dat ošetřuje pouze vnitřní policejní předpis • Některé nejasné a sporné body, různý právní výklad DNA profil v podobě alfanumerického znaku

43. Typy DNA analýz • Jaderná DNA lidského původu • - nejčastěji prováděná analýza • - založená zpravidla na vyšetření vybraných polymorfních oblastí typu STR • - výsledkem je tzv. DNA profil v podobě alfanumerického řetězce • Analýza Y-chromozomu • - Y-chromozom je u lidí výhradně „mužskou záležitostí“ • - založená rovněž na vyšetření polymorfních oblastí typu STR • - výhodou je jedinečná možnost úspěšně analyzovat DNA muže přítomnou ve vzorku • ženského původu v jinak nedetekovatelném množství (v poměru 1 : 100 i více) • - nevýhodou i výhodou zároveň je skutečnost, že znaky dislokované na Y-chromosomu • se beze změny dědí z otce na syna • Analýza mitochondriální DNA (mt-DNA) • - v jediné buňce je až několik tisíc kopií mt-DNA, která je navíc velmi krátká, tuto • metodu je proto možno aplikovat i na jinak neanalyzovatelné stopy • - analýza je založena na sekvenování dvou tzv. hypervariabilních úseků (HVRI a HVRII) • - nevýhodou je vysoká pracnost a tedy i cena, dědičnost pouze po maternálnílínii • - ve srovnání s jadernou DNA nižší síla identifikace • Analýza DNA non humánního původu - analýza a individuální identifikace DNA zvířecího původu (psi, koně, skot…)

44. Izolace DNA ze vzorku Kolik to stojí a jak dlouho to trvá Klesající kvalita vzorku

45. Kolik to stojí a jak dlouho to trvá • Kvantifikace DNA (je stanovena koncentrace DNA v roztoku, lze realizovat i dodatečně) 3 hodiny 300 Kč • Koncentrace (týká se pouze vzorků o nízké koncentraci DNA nebo vzorků obsahujících inhibitory) 1 hodina a více 150 Kč Alternativní kroky, které lze vypustit

46. Kolik to stojí a jak dlouho to trvá D. PCR reakce (vlastní namnožení analyzovaných oblastí na DNA) 2-3 hodiny 700 - 1 100 Kč E. Analýza PCR produktů (konečně výsledek) 1 hodina (dvě měření) 150 Kč

47. Kolik to stojí a jak dlouho to trvá Sumarizace Kvalitní stopa a bezproblémový průběh analýzy • + D. + E. 4 hodiny 20 minut 880 Kč Problematická stopa • + B. + C. + D. + E. 4 dny a více od 2 100 Kč (jedno vyšetření)

48. INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ KVALITAVzdělávání v oblasti forenzní genetikyreg. č. CZ.1.07/2.3.00/09.0080 Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky. INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ

49. Rok 2007 • 8 laboratoří (policejní i civilní, akreditované i neakreditované) • 4 vzorky simulující běžně zkoumané stopy • 3 vzorky simulují srovnávací materiál • vyžadována analýza STR polymorfismů autosomálních i lokalizovaných na Y chromozomu • Rok 2009/2010 • 10 laboratoří (policejní i civilní, akreditované i neakreditované) • 3 vzorky simulující běžně zkoumané stopy • 2 vzorky simulují srovnávací materiál • nebyla vyžadována analýza STR polymorfismů lokalizovaných na Y chromozomu • Rok 2010/2011 • 12 laboratoří (policejní i civilní, akreditované i neakreditované) • 3 vzorky simulující běžně zkoumané stopy • 2 vzorky simulují srovnávací materiál • nebyla vyžadována analýza STR polymorfismů lokalizovaných na Y chromozomu

50. Rok 2007 22,5% 31,3% • Y-STR polymorfismy počítány jako samostatná analýza • Alela 9.1 v systému D7S820 • prakticky žádný kvalitativní rozdíl mezi akreditovanými a „ostatními“ subjekty • pouze 5 laboratoří vypracovalo i nepovinnou část – určení typu biologické stopy Procento úspěšných laboratoří: 0% !!!!!