CAPÍTULO 2. MARCADORES DE DETERMINACIÓN INDIRECTA (II) Introducción Antígenos eritrocitarios

1. CAPÍTULO 2. MARCADORES DE DETERMINACIÓN • INDIRECTA (II) • Introducción • Antígenos eritrocitarios • Antígenos leucocitarios • Proteínas plasmáticas y enzimas eritrocitarios • Alotipos de las inmunoglobulinas (Grupos GM)

2. Proteínas plasmáticas y enzima eritrocitarias Esquema básico de un sistema de electroforesis Cátodo - Anodo + En el plasma sanguíneo y en los eritrocitos se encuentran disueltas una gran cantidad de proteínas con diferentes funciones, no siempre bien identificadas. Algunas proteínas presentan actividad enzimática (catalizando reacciones bioquímicas en el organismo). Se conocen más de veinte enzimas con carácter polimórfico en los eritrocitos. Casi todas las proteínas son identificables mediante electroforesis. Puede describirse la electroforesis como la migración de moléculas a través de un soporte o medio relativamente inerte bajo la influencia de un campo eléctrico y se basa en la propiedad que tienen las proteínas de adquirir carga eléctrica a determinados valores de pH.

3. Proteínas plasmáticas y enzima eritrocitarias Electroforesis horizontal Mediante la variante más sencilla de electroforesis, las moléculas son sometidas a una diferencia de potencial eléctrico. Para ello se dispone de una fuente de alimentación, con la que se generan las condiciones más adecuadas de voltaje, amperaje y tiempo de exposición. Mediante dos electrodos se transmite la diferencia de potencial entre ambos extremos de una cubeta de electroforesis, en cuyo interior se encuentra un gel por el que se desplazarán las muestras y una solución tamponada que transmite en alguna medida la electricidad. Las moléculas se desplazarán en función de su carga eléctrica y de su peso molecular. Las diferentes variantes de una molécula se reconocen por su diferente recorrido a lo largo del gel.

4. Proteínas plasmáticas y enzima eritrocitarias Electroforesis vertical Existen diferentes variantes de electroforesis, basadas en el peso molecular de las moléculas o en su punto isoeléctrico. Puede ser horizontal, submarina si el gel se encuentra sumergido en el tampón, vertical si las moléculas se desplazan desde arriba hacia abajo, etc.

5. Proteínas plasmáticas y enzima eritrocitarias Electroforesis vertical

6. Incremento de pH _ _ _ _ _ _ _ _ _ + + + + + + + + + C Á T O D O A N O D O pI = 8.6 pI = 6.4 pI = 5.1 Proteínas plasmáticas y enzima eritrocitarias Isoelectroenfoque Mediante la técnica de isoelectroenfoque se crea un gradiente de pH, que contribuye a separar más eficazmente las moléculas cuando éstas tienen diferentes puntos isoeléctricos.

7. Proteínas plasmáticas y enzima eritrocitarias Gel unidimensional: expresión de la proteína codificada por el gen responsable de la anemia de Fanconi

8. Proteínas plasmáticas y enzima eritrocitarias Cubeta de electroforesis de campo pulsante Mediante la técnica de campo pulsante, los polos rotan alrededor del gel, de modo que se obtiene una separación muy fina de las moléculas basada en su peso molecular por toda la superficie del gel.

9. Proteínas plasmáticas y enzima eritrocitarias Gel 2D También puede obtenerse un gel en 2 dimensiones combinando la separación por peso molecular en un eje y el punto isoeléctrico en otro.

10. Proteínas plasmáticas y enzima eritrocitarias Hígado normal Tumor Tipos de tinciones Azul de Coomassie Plata Fluorescencia Para terminar, es preciso realizar una tinción que permita observar la posición de las moléculas analizadas.

11. Proteínas plasmáticas y enzima eritrocitarias Análisis de imagen CAROL http://gelmatching.inf.fu-berlin.de/Carol.html Un programa de análisis de imagen a menudo será útil para identificar las diferentes proteínas, especialmente en los geles 2D.

12. Proteínas plasmáticas y enzima eritrocitarias Nei and Roychoudhury, 1993 Dendrograma obtenido con 26 poblaciones analizadas para 28 marcadores: ABO, DI, FY, JK, K, MNS, P, RH, SE, ACPl, ADA, AKl, ESD, GLOl, G6PD, GPT, PGD, PGM 1, PGM2, GC, HP, PI, TF, HBB, GM, KM, HLA-A, HLA-B, and PTC. Distancia de Nei, neighbor-joining y bootstrap

13. Proteínas plasmáticas y enzima eritrocitarias Nei and Roychoudhury, 1993 En este trabajo, los autores estimaron las fechas y rutas del proceso de colonización de los diferentes continentes, combinando los datos de polimorfismos clásicos con datos paleontológicos.

14. Proteínas plasmáticas y enzima eritrocitarias Giovannoni et al., 2006 En el trabajo de Giovannoni et al., (2006) se compara la población corsa con otras poblaciones del entorno a partir de diferentes marcadores, que incluyen proteinas y enzimas. Se muestran los valores bootstrap de cada nodo.

15. Proteínas plasmáticas y enzima eritrocitarias Mastana et al., 1998 En el trabajo de Mastana se detecta una clina en Europa del alelo 4 del gen de la Apolipoproteina E (APOE*4).

16. Alotipos de las inmunoglobulinas (Grupos GM) Esquema de una molécula de anticuerpo Hay un tipo de polimorfismo proteico que no es analizable mediante electroforesis y que dada su importancia para el estudio de la heterogeneidad de las poblaciones humanas, merece una consideración especial. Son los alotipos de las inmunoglobulinas, entre los que destacan los grupos GM. Se trata de unos polimorfismos que se revelan en las moléculas de las inmunoglobulinas (es decir, en los anticuerpos). La molécula de inmunoglobulina consta de una zona variable y una zona constante. La zona variable es la que se adapta a todo tipo de moléculas reconocidas como extrañas por el organismo (los antígenos) y toma por tanto una enorme variedad de configuraciones. En un mismo organismo habrá un gran número de moléculas de inmunoglobulinas diferenciables por su zona variable. La zona constante es igual en todas las inmunoglobulinas de un individuo y presenta unas pocas variantes en el conjunto de poblaciones humanas. Los grupos GM representan una pequeña parte de la zona constante de las cadenas pesadas y son codificados por 3 genes situados en el cromosoma 14 (14q 32.3).

17. Alotipos de las inmunoglobulinas (Grupos GM) Calderón et al., 1998 Especificidades alotípicas GM de acuerdo a los dos códigos existentes Cada alelo se identifica mediante una serie de reacciones con grupos de anticuerpos, de modo que no puede asociarse un alelo con un anticuerpo, sino con una combinación de reacciones positivas. La compleja técnica se basa en la inhibición de la aglutinación, de modo que se comprueba la cantidad de anticuerpo que ha sido secuestrada en las reacciones específicas antígeno-anticuerpo, mediante su unión posterior a unos eritrocitos que portan una antiglobulina. En caso de no aglutinación, se deduce que el anticuerpo se encuentra unido al antígeno correspondiente.

18. Alotipos de las inmunoglobulinas (Grupos GM) Calderón et al., 1998 Frecuencias haplotípicas GM y KM en el País Vasco Así el haplotipo 1,17 23' 21,28 implica: Alelo 1,17 para el gen 1, por haber dado reacción positiva con los anticuerpos 1 y 17. Alelo 23' para el gen 2, por no haber dado positivo con el anticuerpo 23, el único conocido en este gen. Alelo 21,28 para el gen 3, por haber dado positivo con los anticuerpos 21 y 28.

19. Alotipos de las inmunoglobulinas (Grupos GM) Africa Dugoujon et al., 2004 Frecuencias haplotípicas en diferentes poblaciones N. Africa Europa C. Asia America E. Asia Los haplotipos GM resultan ser marcadores muy útiles, pues permiten diferenciar muy claramente las poblaciones humanas. Oceanía

20. Alotipos de las inmunoglobulinas (Grupos GM) Dugoujon et al., 2004 MDS a partir de frecuencias GM para poblaciones de diferentes continentes.

21. Alotipos de las inmunoglobulinas (Grupos GM) Calderón et al., 1998 MDS y rotación de coordenadas con poblaciones europeas, incluyendo vascos. El origen de la flecha indica la posición geográfica y la punta indica la posición gnética.