Definições: pirogênio endógeno e exógeno , endotoxina bacteriana ( lipopolissacáride )

1. Método Analítico para controle de qualidade microbiológico de produtos estéreis – Pirogênio e endotoxina bacteriana • Definições: pirogênio endógeno e exógeno , endotoxina bacteriana (lipopolissacáride) • Aplicação e abrangência • Ações biológicas da endotoxina bacteriana • Métodos de despirogenização e sua aplicação em produtos estéreis • Produtos Apirogênicos • Teste de pirogênio: método de detecção in vivo • Teste de endotoxina : método de detecção in vitro – Kit LAL • Vantagem e desvantagens dos métodos in vivo e in vitro

2. Método Analítico para controle de qualidade microbiológico de produtos estéreis – Pirogênio e endotoxina bacteriana • Pirogênio: Substância que induz a febre, proveniente de um produto injetável. • São divididos em 2 classes: • Pirogênios exógenos • b) Pirogênios endógenos

3. Método Analítico para controle de qualidade microbiológico de produtos estéreis – Pirogênio e endotoxina bacteriana Pirogênios exógenos: São substâncias originárias fora do corpo e induzem a elevações térmicas quando injetados em humanos e animais. Ex.: Endotoxina bacteriana (lipopolissacarídeo) Mais importante pirogênio exógeno. Outros Pirogênios exógenos: bactéria, fungo, vírus e outros não microbianos, como por exemplo fármacos, esteróides, frações do plasma, e adjuvante sintético muramildipeptídeo. Produtos estéreis = ausência de microrganismos viáveis e apirogênicos

4. Método Analítico para controle de qualidade microbiológico de produtos estéreis – Pirogênio e endotoxina bacteriana • Endotoxinas bacterianas: • São complexos de alto peso molecular associados a membrana externa de bactérias Gram negativas, sejam elas patogênicas ou não. • - São altamente resistentes ao calor, dessecação, tratamentos químicos e pH extremos. • São liberadas durante o processo de multiplicação bacteriana ou quando morrem.

5. Método Analítico para controle de qualidade microbiológico de produtos estéreis – Pirogênio e endotoxina bacteriana Cont. Endotoxinas bacterianas: - Constituem maior fonte de pirôgenio para a Indústria Farmacêutica * Diferença entre endotoxina e lipolissacarídeo (LPS)

6. A atividade biológica da endotoxina está associada ao LPS da membrana externa de bactéria Gram negativa

7. Método Analítico para controle de qualidade microbiológico de produtos estéreis – Pirogênio e endotoxina bacteriana Pirogênios endógenos: É produzido internamente pelo hospedeiro em resposta ao estímulo de pirogênio exógeno. Produtos estéreis: ausência de m.o viáveis e apirogênicos

8. Método Analítico para controle de qualidade microbiológico de produtos estéreis – Pirogênio e endotoxina bacteriana • Aplicação: • Produtos farmacêuticos injetáveis , como fármacos, soluções de injetáveis de pequeno e grande volume. • Produtos correlatos ligados a injetáveis ( seringas, agulhas, catéteres) • Embalagens de acondicionamento de produtos injetáveis • Próteses • Fluidos para infusão

9. Ações Biológicas da Endotoxina Bacteriana • - São tóxicas para a maioria dos mamíferos • Quando injetadas - injeção de células vivas, mortas ou purificadas (LPS), podem causar várias reações fisiológicas, tais como: • Febre • Alteração na contagem de leucócitos • Coagulação intravascular • Hipotensão • Apatia • Dores de cabeça • Convulsão • Até mesmo a morte • Devido a estes fatores, é de grande importância a detecção e eliminação das endotoxinas bacterianas de produtos farmacêuticos injetáveis

10. Processos de Despirogenização • Existem 2 grandes classes de Processos de Despirogenização: • Processo de Inativação • Processo de Remoção

11. Processos de Despirogenização • Processo de Inativação da Endotoxina • Hidrólise ácido – básica ou alcalina • Reduz ou elimina a atividade do LPS, pela desativação do lipídeo A ( considerado responsável pela ação biológica) • HCl 0,05N por 30 min a 100ºC ou • Ácido acético glacial 1% por 2 – 3 h a 100ºC • Aplicação: Despirogenização de materiais

12. Processos de Despirogenização Processo de Inativação da Endotoxina 2) Oxidação - Inativação oxidativa da endotoxina bacteriana com peróxido de Hidrogênio (H2O2). É dependente do tempo, pH e concentração. Aplicação: Eliminação de pirogênio da água estéril para injeção USP, solução salina normal, salina dextrose, lavagem de componentes plásticos na fabricação de correlatos. Vantagem : ausência de peróxido no final do processo Outros produtos, porém com limitações: ácido hipocloroso ou hipoclorito, ácido nítrico, dióxido de selênio,entre outros.

13. Processos de Despirogenização • Processo de Inativação da Endotoxina • 3) Alquilação • Um agente alquilante é o gás óxido de etileno, que, segundo alguns estudos, pode promover a redução da atividade de endotoxinas bacterianas, além de promover a esterilização de produtos. • Aplicação: produtos médicos - hospitalares • Outros agentes alquilantes: tratamento com anidridos acéticos e succínico

14. Processos de Despirogenização • Processo de Inativação da Endotoxina • 4) Processo térmico – Calor seco • Estufas • Túneis por convecção, condução ou irradiação (Infravermelho) • Aplicação: Método de escolha para materiais temoresistentes, como frascos de vidro e instrumentos metálicos • Processo de despirogenização:Exposição do material a 250ºC , no mínimo por 30 min. Ocorre incineração. • Autoclavação não é efetiva para inativação de endotoxinas

15. Processos de Despirogenização • Processo de Inativação da Endotoxina • 5) Radiação Ionizante Cobalto ( Co60) • - Reduz a toxicidade de endotoxinas, porém, são dose dependentes. • Pode aumentar alterações químicas desconhecidas em fármacos e soluções parenterais. • - Seu uso na despirogenização de materiais não tem sido considerado. • Seus riscos podem superar suas propriedades benéficas

16. Processos de Despirogenização • Processo de Inativação da Endotoxina • 6) Polimixina B • - Antibiótico pode anular a atividade do LPS. • - Mais estudos devem ser feitos, pois a Polimixina pode interferir no teste LAL ( para determinação de endotoxina bacteriana in vitro)

17. Processos de Despirogenização • Processo por Remoção de Endotoxina • 1) Lavagem • - Método mais simples e um dos mais antigos para remoção de endotoxinas. • - Efetivo • Lavagem com solvente apirogênico : Água estéril para injetáveis USP. • Aplicação: Vidrarias, dispositivos médicos, tampas e superfícies de materiais.

18. Processos de Despirogenização • Processo por Remoção de Endotoxina • 2) Destilação • - Método mais antido para remoção de endotoxinas. • Mecanismo: Alteração de fase: • L para V – Água ( vapor) e LPS ( Líquido) • LPS ( Alto peso molecular) : tende a cair, devido a gravidade. • b) V para L – ÁguaCondensa, sem as endotoxinas. • Aplicação: Remoção de pirogênio da água

19. Processos de Despirogenização • Processo por Remoção de Endotoxina • 3) Ultrafiltração • Utilização de membranas ultrafiltrantes • Tamanho da subunidade básica do LPS: 10.000 a 20.000 daltons. • Mecanismo: Filtros despirogenantes – exclusão por peso molecular / tamanho da partícula. • Aplicação: Fármacos (ex. antibióticos) e soluções de baixo a médio peso molecular.

20. Processos de Despirogenização • Processo por Remoção de Endotoxina • 4) Osmose reversa • Filtração sobre pressão . • Membranas constituída de acetato de celulose ou poliamida, com pequenos poros para exclusão de partículas. • Mecanismo: Exclusão por tamanho - poros pequenos impedem a passagem de pirogênios. • Aplicação: Produção de água estéril para injeção. Método reconhecido pela USP, assim como o processo de Destilação. • - Consegue remover de 99,5 a 99,9 % da carga pirogênica do sistema.

21. Processos de Despirogenização • Processo por Remoção de Endotoxina • 5) Carvão Ativado • Adição de carvão a solução • Pode ser aplicado em ampla faixa de pH • Mecanismo: Adsorção de partículas pirogênicas (endotoxina) , agitação e remoção do carvão por filtração. • Aplicação: Soluções de eletrólitos. • Limitações: • Pode ocorrer a adsorção de ingredientes ativos, devido sua afinidade por subst. não ionizáveis de elevado peso molecular.

22. Processos de Despirogenização • Processo por Remoção de Endotoxina • 6) Atração por membrana hidrófoba • Polímeros de polipropileno, polietileno, polifluoreto de vinilideno e politetrafluoretileno apresentam afinidade para ligação a endotoxina. • Mecanismo: Processo de microfiltração com estes materiais são empregados permitem efetiva eliminação de endotoxinas por ADSORÇÃO • Aplicação:Subst. instáveis hormônios, antibióticos e substâncias difíceis de despirogenizar pelos métodos tradicionais.

23. Produtos Apirogênicos: • È importante ressaltar que: • Apesar dos métodos de despirogenização, existem limitações ( natureza do produto, riscos envolvidos ou aspectos econômicos) • Deve – se avaliar a natureza do produto ara escolha do processo de despirogenização adequado. • É importante seguir a BPF, para que se possa obter um produto apirogênico e não haver necessidade de tratamentos adicionais

24. Teste de Pirogênio • Teste in vivo • Teste in vitro

25. Teste de Pirogênio : Método in vivo • Também conhecido como Método biológico ou Método in vivo • Teste de hipertermia realizado em coelhos. • Consiste em injetar uma solução nas veias periféricas das orelhas de coelhos. • Após a injeção, verifica-se se ocorre uma reação pirética, ou seja, um aumento da temperatura do corpo do animal (febre). • - A elevação da temperatura indicará a presença de pirogênios na solução.

26. Teste de Pirogênio : Método in vitro • Também conhecido como Teste LAL ou Método in vitro • Teste LAL (Limulus Amebocyte Lysate): proteína de caranguejo • - Caranguejos de espécie Limulus polyphemus • - Ocorre uma reação entre o componente proteico do LAL e a endotoxina bacteriana. • Consiste em adicionar o reagente • LAL , que é uma proteína que coagula • ou gelifica na presença de endotoxinas • bacterianas.

27. Teste de Pirogênio : Método in vitro • Métodos analíticos • Ponto Final de Gelificação • Mais simples e amplamente utilizado • Consiste em adicionar solução e reagente em quantidades iguais em tubo de ensaio despirogenizado. • Mistura-se LAL com a solução a ser analisada e incuba-se por 1h a 37ºC. • Inversão dos tubos a 180º • Positivo: formação de gel • Negativo : não formação de gel

28. Teste de Pirogênio : Método in vitro • Métodos analíticos • 2) Ensaio Turbidimétrico • Permite medida quantitativa da endotoxina em diferentes faixas de concentração • O método é baseado no fato em que: Aumento da concentração de toxina é proporcional ao aumento da turbidez da solução, devido a ppt de proteína coagulável. • Mistura se a solução com o reagente e incuba-se para reação da endotoxina. • Realiza-se a leitura em espectrofotometria de absorção, calculando-se a concentração (compara-se com padrão).

29. Questão Provão / ENADE – 2001 • As diálises peritoneais, administradas em pacientes em hospitais, têm sido causa de infecções. As análises das soluções determinaram a presença de pirogênio. • Quais as consequências para um paciente que recebe formulações medicamentosas injetáveis contaminadas com pirogênio? • b) Como é realizada a pesquisa do pirogênio em medicamentos?