1 / 29

Ievads Molekulārajā Ģenētikā

DNS sintēze (replikācija). DNS. RNS sintēze (transkripcija). RNS. proteīnu sintēze (translācija). PROTEĪNS. aminoskābes. Ievads Molekulārajā Ģenētikā. DNS un RNS Struktūras Genoms DNS Replikācija DNS Reparācija un Rekombinācija Transkripcija, mRNS nobriešana Translācija

rusk
Download Presentation

Ievads Molekulārajā Ģenētikā

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. DNS sintēze (replikācija) DNS RNS sintēze (transkripcija) RNS proteīnu sintēze (translācija) PROTEĪNS aminoskābes Ievads Molekulārajā Ģenētikā • DNS un RNS Struktūras • Genoms • DNS Replikācija • DNS Reparācija un Rekombinācija • Transkripcija, mRNS nobriešana • Translācija • Gēnu Ekspresijas Regulācija • Metodes, Gēnu Inženierija http://priede.bf.lu.lv/ Studiju materiāli / MolekularasBioloģijas / IevadsMolGen / LV

  2. Dažas DNS/RNS analīžu metodikas • Elektroforēze • sadala molekulas pēc lādiņa, izmēriem un struktūras • Hibridizācija • detektē specifiskas sekvences, pamatojoties uz komplementārām mijiedarbībām • Gēnu inženierija (rekombinanto DNS tehnoloģija) • kombinē DNS no dažādiem avotiem • Mutaģenēze • ievieš gēnos interesējošās mutācijas • PCR (Polimerāzes ķēdes reakcija) • pavairo specifiskus DNS fragmentus • Sekvenēšana • nosaka DNS fragmentu nukleotīdu secību

  3. ELEKTROFORĒZE sadala DNS molekulas pēc izmēriem bufera šķīdums agarozes gēls DNS fragmenti elektrods elektrods elektrods elektrods mazāki DNS fragmenti pārvietojas ātrāk (tālāk) par lielākiem Molecular Biology of the Gene, 5th Edition

  4. HIBRIDIZĀCIJA detektē specifiskas DNS vai RNS sekvences Hibridizācijas metodes princips zonde denaturācija hibridizācija hibridizējusies zonde Life The Science of Biology, 7th Edition

  5. HIBRIDIZĀCIJA detektē specifiskas DNS vai RNS sekvences Hibridizācijas apstākļu ietekme uz rezultātu gēna A zonde; vienpavediena DNS analizējamo DNS maisījums; vienpavediena formā (denaturētas) hibridizācija 50% formamīdā 35oC temperatūra 42oC temperatūra nekomplementaritāte A, C un E veido stabilu divpavedienu DNS tikai A veido stabilu divpavedienu DNS

  6. HIBRIDIZĀCIJA detektē specifiskas DNS vai RNS sekvences Gēnu lokalizēšana hromosomās

  7. HIBRIDIZĀCIJA detektē specifiskas DNS vai RNS sekvences Gēnu ekspresijas analīze gēnu-specifisku DNS molekulu kolekcija PCR amplifikācija ‘printēšana’ uz slaida (mikročipa) mRNS no parauga 2 iezīmētas ar zaļu fluorescentu iezīmi mRNS no parauga 1 iezīmētas ar sarkanu fluorescentu iezīmi HIBRIDIZĒ SKALO SKENĒ SARKANOS UN ZAĻOS SIGNĀLUS; APVIENO ATTĒLUS neliels mikročipa rajons, kas satur zondes 110 rauga gēniem

  8. GĒNU INŽENIERIJA kombinē DNS no dažādiem avotiem RESTRIKCIJAS ENDONUKLEĀZES šķeļ specifiskas DNS sekvences ŠĶĒLUMS ŠĶĒLUMS ŠĶĒLUMS ŠĶĒLUMS

  9. GĒNU INŽENIERIJA kombinē DNS no dažādiem avotiem Restrikcijas produktus ar atbilstošiem lipīgiem galiem var viegli savienot galu salipšana (“annealing”)

  10. GĒNU INŽENIERIJA kombinē DNS no dažādiem avotiem VEKTORI nodrošina ģenētiskā materiāla “transportu” • Prasības vektoram • Spēja replicēties neatkarīgi no saimnieka • Restriktāžu atpazīšanas vietas • “Reportiera” gēns(-i) • Relatīvi neliels izmērs pBR322 plazmīda saimnieks: E.coli ampicilīna rezistences gēns (ampr) tetraciklīna rezistences gēns (tetr) replikācijas sākums (ori)

  11. GĒNU INŽENIERIJA kombinē DNS no dažādiem avotiem DNS fragmenta klonēšana plazmīdas vektorā ar rekombinanto plazmīdu transformē Escherichia coli tetraciklīna rezistences gēns EcoRI gali plazmīda DNS ligāze savieno fragmentu ar vektoru transformētās šūnas izsēj barotnē, kas satur tetraciklīnu rekombinanta plazmīda izdzīvo un veido kolonijastikai tās baktērijas, kuras transformētas ar rekombinanto plazmīdu Molecular Biology of the Gene, 5th Edition

  12. GĒNU INŽENIERIJA kombinē DNS no dažādiem avotiem Klonētā DNS fragmenta pavairošana baktērijas šūnas (kolonijas), kas satur rekombinanto plazmīdu pavairota un attīrīta rekombinantā plazmīda šūnu kultūra producē simtiem miljonu kopiju modificēts

  13. GĒNU INŽENIERIJA kombinē DNS no dažādiem avotiem EKSPRESIJAS VEKTORI ļauj iegūt lielus daudzumus proteīna ekspresijas vektors promoters ribosomu saistības rajons transkripcijas terminators ekspresējamais gēns (kodējošā sekvence) gēns Life The Science of Biology, 7th Edition

  14. DNS BIBLIOTĒKAS cilvēka divpavedienu DNS šķeļ ar restrikcijas endonukleāzēm miljoniem DNS fragmentu klonē plazmīdās rekombinantās DNS transformē baktērijas genomiskās DNS bibliotēka

  15. kDNS (kopijas DNS) iegūšana lizē šūnas un attīra mRNS audi (piem., smadzenes) mRNS hibridizē ar poli-T praimeri ar reverso transkriptāzi iegūst komplementāru DNS mRNS ar RNāzi H degradē RNS kDNS ar DNS polimerāzi sintezē otru kDNS ķēdi; RNS fragments darbojas kā praimeris mRNS divpavedienu kDNS kopija

  16. Genomiskās DNS un kDNS bibliotēku atšķirības hromosomālā DNS gēns B gēns B gēns A gēns A eksons introns netranskribējamais DNS rajons TRANSKRIPCIJA ŠĶELŠANA AR RESTRIKCIJAS ENDONUKLEĀZI RNS transkripts RNS SPLAISINGS DNS fragmenti mRNS DNS KLONĒŠANA REVERSĀ TRANSKRIPCIJA UN DNS KLONĒŠANA kDNS kloni kDNS bibliotēkā genomiskās DNS kloni genoma DNS bibliotēkā

  17. Ar MUTAĢENĒZI gēnos ievieš interesējošās mutācijas klonēts normāls gēns vektors pavedienu atdalīšana sintētisks praimeris, kas satur vēlamo mutanto sekvenci DNS sintēze un ligēšana (DNS polimerāze un ligāze) šūnu transformācija, DNS replikācija un šūnu dalīšanās TRANSKRIPCIJA TRANSKRIPCIJA TRANSLĀCIJA TRANSLĀCIJA normāls proteīns proteīns, kas satur vēlamo aminoskābes apmaiņu

  18. TRANSGĒNIE DZĪVNIEKI dod iespēju noskaidrot gēnu funkcijas Dzīvniekos var ieviest dažādas izmaiņas NORMĀLS GĒNS X GĒNA PIEVIENOŠANA GĒNA AIZVIETOŠANA GĒNA NOKAUTS nav aktīva gēna aktīvs gan mutantais, gan normālais gēns tikai mutantais gēns ir aktīvs

  19. Transgēno dzīvnieku izveidošana embrionālās cilmes šūnas (EC šūnas) siev.dz. pele fragmentu ievada šūnās DNS fragments ar mutanto gēnu izolē agrīnas fāzes embriju mutantās EC šūnas injicē agrīnas fāzes embrijā izaudzē kolonijas agrīnās fāzes embrijā daļa šūnu ir mutantas atrod (retās) kolonijas, kurās mutantais variants aizstājis normālo gēnu embriju implantē surogātmātei embrionālās cilmes šūnas, kurās viena mērķgēna kopija aizvietota ar mutanto gēnu daļa somatisko šūnu satur mutanto gēna versiju; atrod tādas peles, un izmanto sapārošanai TRANSGĒNĀ PELE SATUR MUTANTO GĒNA KOPIJU DZIMUMŠŪNĀS TRANSGĒNIE DZĪVNIEKI dod iespēju noskaidrot gēnu funkcijas

  20. TRANSGĒNIE DZĪVNIEKI dod iespēju noskaidrot gēnu funkcijas Transgēna pele (B), kura ekspresē mutantu DNS helikāzi

  21. praimeris dNTF (dezoksiribonukleozīdu trifosfāti) sintezējamā DNS pavediena ‘augošais’ gals bāze matricas DNS pavediens vienpavediena DNS divpavedienu DNS Atgādinājums par to, kā dabā notiek DNS sintēze (replikācija) Molecular Biology of the Gene, 5th Edition katalīze praimeris bāzu sapārošana matrica pirofosfatāze

  22. POLIMERĀZES ĶĒDES REAKCIJA (PCR) amplificē DNS fragmentus DNS polimerāze +dATF +dGTF +dCTF +dTTF karsēšana, lai atdalītu pavedienus (denaturācija) praimeru hibridizācija DNS sintēze no praimeriem divpavedienu DNS 1. solis 3. solis 2. solis PIRMAIS CIKLS DNS denaturē un hibridizē ar praimeriem DNS sintēze DNS denaturē un hibridizē ar praimeriem DNS sintēze DNS denaturē un hibridizē ar praimeriem DNS sintēze DNS oligonukleotīdu praimeri amplificējamais divpavedienu DNS rajons OTRAIS CIKLS (producē 4 divpavedienu DNS molekulas) TREŠAIS CIKLS (producē 8 divpavedienu DNS molekulas) PIRMAIS CIKLS (producē 2 divpavedienu DNS molekulas) Molecular Biology of the Cell, 4th Edition

  23. PCR pielietojums kriminālistikā – DNS ‘pirkstu nospiedumi’ Molecular Biology of the Cell,4th Edition

  24. DNS SEKVENĒŠANA pēc Sangera metodes 2’, 3’- didezoksi ATF 2’- dezoksi ATF F. Sanger (1975) – didezoksi (ķēdes terminācijas, enzimātiskā) metode praimeris praimeris Molecular Biology of the Gene, 5th Edition

  25. DNS SEKVENĒŠANA pēc Sangera metodes neliels daudzums viena terminatora ddATF normālie dezoksiribonukleozīdu trifosfāti dGTF, dATF, dTTF, dCTF ddATF inkorporācija bloķē tālāko sintēzi praimeris sekvenējamais DNS pavediens

  26. DNS SEKVENĒŠANA pēc Sangera metodes divpavedienu DNS praimeris vienpavediena DNS dATF, dTTF, dCTF, dGTF pārākums un DNS polimerāze Radioaktīvi iezīmēts praimeris vai kāds no dNTF + ddATF +ddTTF +ddCTF +ddGTF Nukleotīdu sekvenci nolasa tieši no gēla virzienā no apakšas uz augšu:

  27. DNS SEKVENĒŠANA pēc Sangera metodes

  28. DNS SEKVENĒŠANA pēc Sangera metodes fluorescenti iezīmēti ddNTF sekvenēšanas reakcijas kapilārā elektroforēze detektors dators Genomes, 2nd Edition

  29. Cilvēka Genoma sekvences – 2001 (2004)

More Related