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Estudo de promotores: a técnica de DNA footprinting

Estudo de promotores: a técnica de DNA footprinting. RNA. A B C. Filme raio X ou Phosphoimager?. In Situ Hybridization. In situ hybridization of a Drosophila embryo with probes for even-skipped (red) and hunchback (green). DNA imobilizado em filtros.

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Estudo de promotores: a técnica de DNA footprinting

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Presentation Transcript

  1. Estudo de promotores: a técnica de DNA footprinting

  2. RNA A B C

  3. Filme raio X ou Phosphoimager?

  4. In Situ Hybridization In situ hybridization of a Drosophila embryo with probes for even-skipped (red) and hunchback (green).

  5. DNA imobilizado em filtros F E D C B A K J I H G L R S T V X Z Núcleo de hepatócito Núcleo de cel de rim Transcrição constitutiva Transcrição específica em hepatócitos Nuclear Run on “fotografia”

  6. - RT + RT RT-PCR

  7. Quantificação de RNA por Real-Time PCR Detecção de fluorescência gerada em cada ciclo de amplificação: - SYBR green - Primers fluorescentes

  8. Determinação do limiar de detecção Ct

  9. O valor de Ct é correlacionado com a quantidade inicial de DNA amplificado

  10. Estudos de expressão de mRNA em escala genômica: High throughput analysis • Microarrays • cDNAs • Oligos • Gene chips (Affymetrix) • ESTs • SAGE

  11. Spotter – podem ser oligos ou cDNA

  12. Estudos de expressão de mRNA em escala genômica:DNA Microarray

  13. Cada cDNA de uma cor (vermelho ou verde) Igualmente ligados = amarelo

  14. O chip

  15. Sintese na lamina (chip)

  16. Affymetrix

  17. Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica DNA footprinting Band shift Transfecção com gene reporter Duplo-híbrido CHIP (chromatin immunoprecipitation Técnicas de estudo de expressão gênica em escala genômica DNA Microarray Análise de EST (expressed sequence tags) SAGE (serial analysis of gene expression)

  18. Quantificação da expressão de um mRNA • Northern blot e RUN ON • Proteção à RNAse H (RNA radioativo pareia) • RT-PCR (reverse transcribed) • Real Time PCR

  19. Luciferase assay Estudo de promotores: transfecção c/ gene repórter • Genes repórteres • CAT • Luciferase • b-gal (controle de transfecção)

  20. Estudo de promotores: a técnica de band-shiftEletrophoretic Mobility Shift Assay EMSA

  21. CHIP: Imunoprecipitação da cromatina

  22. Análises de EST

  23. SAGE: Serial Analysis of Gene Expression

  24. Duplo-híbrido em levedura

  25. Estudos de expressão de mRNA em escala genômica:DNA Microarray

  26. Hybridize to DNA chip with 6361 spots, representing all the known intergenic regions in the yeast genome. Average size of the spotted PCR = 480 bp Yeast genome/proteome database: 12Mb ~6000 genes (50% with assigned function) 10% involved in transcription 141 with their activity tested: myc-tagging Anti-Myc

  27. CHIP e Microarray podem identificar todos os genes regulados por um mesmo fator de transcrição 6361 spots, representing all of the known intergenic regions in the yeast genome. (average size = 480 bp)

  28. Identificação de sequencias regulatóriasreconhecidas por uma RBP

  29. Polissomos Monossomos e subunidades ribossomais Frações contendo mRNA associado a polissomos cada vez maiores Marcação de cDNA e hibridização Estudo da regulação da tradução Uso de Microarray para identificação de genes associados a polissomos

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