Biosyntéza polyketidov ých antibiotik ve streptomycet ách

1. Biosyntéza polyketidových antibiotikve streptomycetách Laboratoř molekulární biologie aktinomycet

2. Chemická struktura látek ze skupiny manumycinu ASUKAMYCIN C5N jednotka MANUMYCIN A MOENOMYCIN BAFILOMYCIN B1 REDUCTIOMYCIN

3. kaspázy-1 • neutrální sfingomyelinázy • IkB kinázy • Ras farnesyltransferázy • acetylcholin esterázy mechanismem enzymové inhibice Biologické aktivity metabolitů ze skupiny manumycinu MANUMYCINY A, E, F, G; ASUKAMYCIN, COLABOMYCIN • Antibakteriální (zejména proti G+) • Protizánětlivá • Anti-apoptotická • Kancerostatická • Další (insekticidní, kokcidiostatické, antifungální apod.) Další látky obsahující C5N jednotku MOENOMYCIN A Antibakteriální (zejména proti G+), alternativa b-laktamů ve veterinární medicíně REDUCTIOMYCIN Antibakteriální, antifungální a protivirová (New Castle disease virus) BAFILOMYCIN B1 Specifický vakuolární ATPasový inhibitor, inhibitor vesikulárního transportu

4. Biosyntetický model manumycinových metabolitů Polyketidy – Biosyntetický model založený na výsledcích chemického značení molekul asukamycinu a manumycinu • PKS-I • C7N - dioxygenasa • C5N - biosyntetické dráhy ALA

5. G35 G37 G31 G32 G33 G34 G36 G38 G39 G310 G41 G42 G43 G44 G45 G46 G47 59 58 23-24 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 30 29 28 27 26 25 22 21 20 19 18 17 16 38 13 12 11 10 9 Als 1 2 3 3-1 4 4-1 5 6 7 8 14 41 G115 42 43 44 45 46 47 G101 G111 G112 G113 G114 G116 G117 G118 G121 G122 G123 G125 G124 G126 G127 G128 G131 G132 G133 G134 G141 Biosyntetický genový shluk asukamycinuze S. nodosus ssp. asukaensis

6. In silico analýza asukamycinového shluku

7. DisrupcealsveS. nodosus ssp. asukaensis WT als::apr

8. G35 G37 G31 G32 G33 G34 G36 G38 G39 G310 G41 G42 G43 G44 G45 G46 G47 59 58 23-24 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 30 29 28 27 26 25 22 21 20 19 18 17 16 38 13 12 11 10 9 Als 1 2 3 3-1 4 4-1 5 6 7 8 14 41 G115 42 43 44 45 46 47 G101 G111 G112 G113 G114 G116 G117 G118 G121 G122 G123 G125 G124 G126 G127 G128 G131 G132 G133 G134 G141 Metabolity produkované mutanty als a asu17

9. G35 G37 G31 G32 G33 G34 G36 G38 G39 G310 G41 G42 G43 G44 G45 G46 G47 59 58 23-24 57 56 55 54 53 52 51 50 49 48 30 29 28 27 26 25 22 21 20 19 18 17 16 38 13 12 11 10 9 Als 1 2 3 3-1 4 4-1 5 6 7 8 14 41 G115 42 43 44 45 46 47 G101 G111 G112 G113 G114 G116 G117 G118 G121 G122 G123 G125 G124 G126 G127 G128 G131 G132 G133 G134 G141 Biosyntetický model asukamycinu • Řetězce jso syntetizovány PKS-II • Epoxidace probíhá mechanismem monooxygenázy • C5N vzniká pravděpodobně spolupůsobením ALAS a CoA-ligázy • Gen asu5 kóduje aldolázu, podílející se natvorbě mC7N • Gen asu23-24 se podílí na biosyntéze cyklohexylového zbytku – startovací jednotky horního řetězce

10. TLC analýza produkčního média als mutantu 1, S. nodosus WT kmen; 2, als::aac(3)IV mutant; 3, als::aac(3)IV x pALS4; 4, als::aac(3)IV mutant s 20mg ml-1 ALA; 5, asukamycin

11. Metodika genetického screeningu pro vyhledávání nových producentů látek s C5N jednotkou ALS GTR • Vysoká homologie DNA sekvence genu als u všech známých producentů (více než 80%) • Vysoce konzervativní vnitřní fragment kódující sekvence als jako genová próba pro hybridizační screening: • Jednoznačné výsledky – genomová DNA všech producentů hybridizuje, neprodukční kmeny bez signálu • Vysoká citlivost • V pilotním experimentu kromě známých kmenů analyzováno cca 60 nových izolátů aktinomycet z přírody – identifikace produkčního kmene S.sp.1/5 (původ - primární sukcese hnědouhelné výsypky, Mostecko) • Pro snadnou identifikaci metabolitů s C5N jednotkou: • C5N je UV chromofor • Antibakteriální aktivita • Transformace libovolného producenta expresním plasmidem pro nadexpresi genu als z S. nodosus specificky zvyšuje syntézu C5N-obsahujících látek minimálně o řád Dráha 1 – pIJ622 Dráha 2 – pALS4