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Ministero dell'Università e della Ricerca Scientifica e Tecnologica

Ministero dell'Università e della Ricerca Scientifica e Tecnologica. Facoltà di Farmacia Dipartimento di Chimica e Tecnologie Farmaceutiche DOTTORATO DI RICERCA in Tecnologie delle Sostanze Biologicamente Attive A.A. 2004/2005. Università degli Studi di Palermo.

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  1. Ministero dell'Università e della Ricerca Scientifica e Tecnologica Facoltà di Farmacia Dipartimento di Chimica e Tecnologie Farmaceutiche DOTTORATO DI RICERCA in Tecnologie delle Sostanze Biologicamente Attive A.A. 2004/2005 Università degli Studi di Palermo NUOVI IDROGELI A BASE DI POLIAMMINOACIDI E POLISACCARIDI PER APPLICAZIONI NEL RILASCIO MODIFICATO E DIREZIONATO DI FARMACI E NELL’INGEGNERIA TISSUTALE Tesi di Dottorato di Rossella Calabrese Tutor Ch.ma Prof. Giovanna Pitarresi Coordinatore Ch.mo Prof. Gaetano Giammona

  2. ALIMENTARE AGRICOLO COSMETICO FARMACEUTICO BIOMEDICO • drug delivery systems • biomateriali per ingegneria tissutale • gene delivery systems • lenti a contatto • Rivestimenti per tessuti artificiali e medical devices • alta idrofilia • alto contenuto d’acqua • consistenza “soft” • VERSATILITÀ AFFINITÀ AI TESSUTI BIOLOGICI E BIOCOMPATIBILITÀ Network polimerici idrofili capaci di rigonfiare in mezzo acquoso mantenendo la loro struttura tridimensionale IDROGELI

  3. IDROGELI drug delivery systems biomateriali per ingegneria tissutale

  4. Temperatura Luce Campo elettrico Campo magnetico pH Molecole specifiche Ioni • IDROGELI COME • DRUG DELIVERY SYSTEMS IDROGELI Sensibili a stimoli esterni • “ENVIRONMENT SENSITIVE” SISTEMI INTELLIGENTI PER IL RILASCIO MODIFICATO DI MOLECOLE BIOATTIVE

  5. RILASCIO AL COLON • Trattamento “locale” di patologie del colon • Farmaci incompatibili con un rilascio gastrico pH pH1.0-3.0 • idrogeli degradabili a livello del colon pH6.8-7.3 pH pH 5.5-6.8 Degradazione enzimatica POLISACCARIDI DEGRADABILI DALLA FLORA MICROBICA DEL COLON Enzimi prodotti dalla flora microbica colica Idrogeli stimolo sensibili e rilascio G-I • idrogeli pH-sensibili

  6. SCOPO DELLO STUDIO Preparazione di nuovi idrogeli pH-sensibili e biodegradabili, come drug delivery systems colon specifici

  7. INULINA (INU) DESTRANO (DEX) Idrogeli a base di un derivato dell’INU mediante reticolazione chimica (addizione tipo Michael) Idrogel composito a base di derivati del DEX e dell’α,β-poli(N-2-idrossietil)-DL-aspartammide (PHEA) mediante reticolazione UV-indotta IDROGELI A BASE DI POLISACCARIDI DEGRADABILI NEL COLON

  8. DESTRANO (DEX) polimero sintetico foto-reattivo biocompatibile SISTEMI COMPOSITI DEX-MA • POLISACCARIDE NATURALE • IDROSOLUBILE • BIOCOMPATIBILE • DEGRADABILE NEL COLON (DESTRANASI) Idrogeli a base di DEX mediante UV-crosslinking di derivati foto-reattivi • DEGRADABILITÀ • DD <4% completa • DD ≥7% scarsa o nulla *M.Giannuzzo et al. J Drug Del Sci Tech 16 (2006) 49-54 §G. Pitarresi et al. J Control Release 119 (2007) 328–338

  9. PHM-SA PHM DERIVATIZZAZIONE CON GRUPPI SUCCINICI: pH-SENSIBILITA’ DERIVATIZZAZIONE CON GRUPPI METACRILICI: FOTO-REATTIVITA’ α,β-poli(N-2-idrossietil)-DL-aspartammide (PHEA) Poliamminoacido sintetico idrosolubile, biocompatibile *Idrogeli pH-sensibili, mediante UV-crosslinking del PHM-SA come drug delivery systems *D. Mandracchia et al. Biomacromolecules 5 (2004) 1973-82

  10. SISTEMI COMPOSITI POLISACCARDIDE/POLIAMMINOACIDO DEX-MA-SA + PHM-SA • Reticolazione UV-indottain assenza di foto-iniziatori • Degradabilità colon-specifica • pH-sensibilità

  11. Sintesi del DEX-MA-SA X = mol SA/mol U.R. DEX-MA mol SA=mol TEA pH-sensibilità Reattività X = 0.25 Sintesi del DEX-MA mol GMA/ mol U.R. DEX=1/6 DD in MA = 20 ± 1 mol% DD in SA = 21 ± 1 mol%

  12. Sintesi del PHM-SA X’ = 0.5 Y’ = 0.2 X’ = mol SA/mol U.R. PHEA Y’ = mol TEA/ mol SA REATTIVITÀ DEGRADABILITÀ Sintesi del PHM X = 0.5 Y = 0.5 X = mol MA/mol U.R. PHEA Y = mol TEA/mol MA pH-sensibilità DD = (mol SA/mol U.R. PHEA) x 100 = 35 ± 1 mol% DD = (mol MA/mol U.R. PHEA) x 100 = 30 ± 1 mol%

  13. PROVE PRELIMINARI: combinazione ottimale DEX-MA-acido/poliaminoacido ? UV-crosslinking di DEX-MA-SA e di PHM-SA in rapporto 20/80

  14. Idrogeli compositi DEX-MA-SA/PHM-SA *UV 90 min 313 nm PHM-SA DEX-MA-SA * Soluzione acquosa polimerica 7%p/v Rapporto p/p DEXMASA/PHMSA =1/4 UV crosslinking senza fotoiniziatori Network DEX-MA-SA/PHM-SA

  15. Caratterizzazione dell’idrogel DEX-MA-SA/PHM-SA • Analisi FT-IR • Studi di swelling • Studi di idrolisi chimica ed enzimatica • Studi di citocompatibilità in vitro • Studi di interazione con la mucina • Studi di drug release

  16. Wagging C=C Scissoring C=C Analisi FT-IR DEX-MA-SA 815 1340 PHM-SA 950 815 UV-crosslinked DEX-MA-SA/PHM-SA 1300

  17. swelling • BIOCOMPATIBILITÀ • DEGRADABILITÀ • PERMEABILITÀ E DIFFUSIONE Swelling ratio misurato in continuo pH 1.0  pH 6.8 Studi di swelling * All’equilibrio di rigonfiamento pH-sensibilità

  18. Studi di idrolisi FGS = HCl 0.1 N, pH 1.0 FIS = Na2HPO4/KH2PO4 , pH 6.8 PBS = NaCl/Na2HPO4/KH2PO4 , pH 7.4 Chimica * Misurati dopo 24 ore Destranasi Esterasi q in d.d.H2O= 23.3  0.5 Enzimatica * Misurati dopo 24 ore

  19. Trypan blue assay MTS assay Vitalità cellulare % = (Absc/AbsK) x 100 vitalità cellulare %= (n. cellule vive/n. cellule totali) x 100 Studi di citocompatibilità in vitro • DIRETTA • INDIRETTA Cellule: Caco-2 (1*105/ml) Mezzo di coltura: MEM (10 % in FBS) Incubazione con i campioni: 24 h Condizionamento: 37°C, 120 rpm, 5 giorni b a a) Cellule Caco-2 incubate a contatto con l’idrogel DEX-MA-SA/PHM-SA b) Controllo positivo

  20. T % a 500 nm di dispersioni di mucina in presenza di DEX-MA-SA, PHM-SA, miscela 1:4 DEX-MA-SA/PHM-SA (D/P) o HA (controllo positivo) Studi di interazione con la mucina Metodo turbidimetrico > Interazioni polimero/mucina < valori di T

  21. 2-metossiestradiolo (2-ME) R= CH3O 2-ME R= H Estradiolo-17 Drug loading: impregnazione “drug loading” 10% p/p Idrogel DEX-MA-SA/PHM-SA Idrogel DEX-MA-SA/PHM-SA + 2-ME 2-ME in EtOH 4 giorni Idrogel DEX-MA-SA/PHM-SA come drug delivery system • Metabolita endogeno degli estrogeni • Forte attività anti-tumorale • Azione anti-angiogenica • Azione pro-apoptotica (caspasi) Trattamento del carcinoma colon-rettale

  22. + DEGRADABILITA’ pH-SENSIBILITA’ FIS pH 6.8 FGS pH 1.0 Drug release • Dopo 2 h in PBS pH 6.8 • In assenza di enzimi (controllo) • in presenza di destranasi (D)/esterasi (E) Per 2h in HCl 0.1 N LA NATURA DELL’IDROGEL INFLUENZA IL PROFILO DI RILASCIO ANDAMENTO BIFASICO

  23. INULINA (INU) DESTRANO (DEX) Idrogeli a base di un derivato dell’INU mediante reticolazione chimica (addizione tipo Michael) Idrogel composito a base di derivati del DEX e dell’α,β-poli(N-2-idrossietil)-DL-aspartammide (PHEA) mediante reticolazione UV-indotta IDROGELI A BASE DI POLISACCARIDI DEGRADABILI NEL COLON

  24. sistemi farmaceutici per la veicolazione di farmaci a livello del colon Idrogeli a base di Inulina • USO IN CAMPO BIOMEDICO E FARMACEUTICO • Biocompatibile • Biodegradabile (INULINASI) • non tossico • facile reperibilità a basso costo L’INU è un fruttano e consiste di catene lineari di unità di fruttosil fruttosio legate tramite legami β-1,2 • “cibo fisiologicamente funzionale” • NDO • prebiotico • Effetti + sull’omeostasi lipidica • Modulazione risposta immune

  25. Idrogeli a base di Inulina Mediante reticolazione chimica: addizione tipo Michael • Derivatizzazione INU con: • gruppi ene (divinil sulfone) reattività • gruppi acidi (anidride succinica) pH-sensibilità

  26. Derivatizzazione dell’INU conDV ed SA X = mol DV/ mol U.R. INU Y = molTEA/mol U.R. INU X'=mol SA/ mol U.R.INU Resa = 90 % p/p DD mol in DV = 25 % DD mol in SA = 50 % • Approccio originale • Alte rese • Non si ha reticolazione tra DV e INU

  27. Z=mol TT/mol U.R. INUDVSA Z=1.5 TRIMETILOLPROPANO TRIS(3-MERCAPTOPROPIONATO) Reticolazione dell’INUDVSA

  28. FT-IR INUDVSA INUDVSA-TT8 C=C INUDVSA-TT24 CH2 C=C C=O Idrogeli INUDVSA-TT • Analisi FT-IR • Studi di swelling • Studi di idrolisi chimica ed enzimatica • Studi di citocompatibilità in vitro

  29. FGS pH 1.0 FIS pH 6.8 Studi di swelling H2O bidistillata HCl 0.1N (FGS) PBS pH 6.8 (FIS) Comportamento pH-sensibile

  30. DEGRADAZIONE CON ESTERASI Incremento *q % = *qf -*qi x 100 Degradazione %= (Wi-Wf)/Wi x 100 *q dopo 24 h in acqua bidistillata Studi di idrolisi enzimatica INULINASI 2,1-β-D-fruttan-fruttano idrolasi che scinde le unità di fruttosio dall’estremità non riducente della molecola di INU DEGRADAZIONE CON INULINASI Metodo dell’antrone Degradazione%= Fruttosioc/Fruttosiotot x100

  31. Cellule: Caco-2 (1*105/ml) Mezzo di coltura: MEM (10 % in FBS) Incubazione con i campioni: 24-48 h Campioni: MEM “condizionato” con idrogeli INUDVSA-TT (TEST INDIRETTO) Condizionamento: 37°C, 120 rpm, 5 giorni Metodo di analisi:MTS assay Cellule: Caco-2 (1*105/ml) Mezzo di coltura: MEM (10 % in FBS) Incubazione con i campioni: 24-48 h Campioni: idrogeli INUDVSA-TT (TEST DIRETTO) Metodo di analisi:MTS assay Studi di citocompatibilità in vitro Metodo diretto Metodo indiretto

  32. (2-ME) Studi di DRUG RELEASE Profilo di rilascio del 2-ME dagli idrogeli INUDVSA-TT e di dissoluzione del 2-ME puro in miscela HCl 0.1N/DMSO 80:20 per le prime 2 ore o PBS pH 6.8/DMSO 80:20 fino alle 48 ore Idrogeli INUDVSA-TT come drug delivery systems • Drug loading dopo IMPREGNAZIONE (EtOH) • INUDVSA-TT8 = 16.5 % p/p • INUDVSA-TT24 = 16.1 % p/p

  33. TUNEL assay MTS assay CONTROLLO 2-ME rilasciato dopo 48 h da INUDVSA-TT8 Hoechst 33258 A B C 2-ME rilasciato dopo 48 h da INUDVSA-TT24 Frammentazione nucleare evidenziata mediante colorazione Hoechst 33258 ( ex/ em 350/450 nm). Cellule non trattate (A), trattate con il 2-ME rilasciato dopo 48 h, INUDVSA-TT8 (B) o INUDVSA-TT24 (C) EFFICACIA PRO-APOPTOTICA Cellule Caco-2 trattate con il 2-ME rilasciato dopo 48 h dagli idrogeli a pH 6.8 Tempo incubazione: 72 h APOPTOSI

  34. Conclusioni IDROGELI A BASE DI POLISACCARIDI DEGRADABILI NEL COLON IDROGELI COMPOSITI DEX-MA-SA/PHM-SA UV-crosslinking senza foto-iniziatori IDROGELI INUDVSA-TT Reticolazione chimica dell’INUDVSA con TT • pH-sensibilità • degradabilità colon-specifica • citocompatibilità in vitro • profilo di rilascio di 2-ME pH-dipendente • effetto apoptotico del 2-ME • pH-sensibilità • degradabilità colon-specifica • citocompatibilità in vitro • rilascio di 2-ME controllato sia dalla degradazione enzimatica che dalle variazioni di pH POTENZIALE APPLICAZIONE COME SISTEMI PER IL RILASCIO DI FARMACI AL COLON

  35. IDROGELI drug delivery systems biomateriali per ingegneria tissutale

  36. 2. IDROGELI COME BIOMATERIALI PER INGEGNERIA TISSUTALE IDROGELI Settore di ricerca multidisciplinare volto alla produzione di sistemi per la sostituzione, la rigenerazione o la produzione di tessuti e organi SCAFFOLD

  37. SCAFFOLD Biomateriali di supporto che mimano l’ECM, favorendo adesione, migrazione e proliferazione cellulare per la formazione di un nuovo tessuto Extra Cellular Matrix • biocompatibilità • adeguate proprietà meccaniche • degradabilità • proprietà di diffusione • possibilità di incorporarvi molecole bioattive e/o cellule (VEICOLAZIONE)

  38. Geni terapeutici Fattori di crescita GENE DELIVERY INGEGNERIA TISSUTALE Gene Activated Matrix (GAM) Cellule nello scaffold Scaffold polimerico Cellule transfettate Gene terapeutico (codifica per un fattore di crescita cellulare) LE CELLULE “SONO STIMOLATE AD AUTOSTIMOLARSI” MEDIANTE PRODUZIONE AUTOCONTROLLATA DI PROTEINE TERAPEUTICHE PER LA RIGENERAZIONE DI TESSUTO FUNZIONALE

  39. Biomateriali di scelta • Biocompatibili • Biodegradabili • Non immunogeni • Promozione delle funzioni cellulari • Facile rigenerazione dei tessuti molli • Scarse proprietà meccaniche

  40. Acido ialuronico (HA) • È il più semplice fra i GAGs e si trova nella ECM dei tessuti biologici • POLISACCARIDE BIOLOGICAMENTE ATTIVO • E’ naturalmente degradato dall’ HAase Regolazione di proliferazione, rigenerazione e riparazione tissutale • SCARSE PROPRIETÀ MECCANICHE • DEGRADAZIONE ENZIMATICA (HAase) • NON STIMOLA L’ADESIONE CELLULARE BIOMATERIALI COMPOSITI

  41. SCOPO DELLO STUDIO , -poli(N-2-idrossietil) (2-amminoetilcarbammato)-D,L-aspartammide (PHEA-EDA o PE) derivato del PHEA Preparazione e caratterizzazione di idrogeli compositi a base di HA e di un poliamminoacido sintetico per applicazioni nel campo della medicina rigenerativa

  42. FASI DELLO STUDIO 1. Film polimerici compositi mediante reticolazione chimica di HA in presenza di PE 2. Scaffold compositi HA-PE per il rilascio modificato di DNA (GAM )

  43. Sintesi dell’, -poli(N-2-idrossietil) (2-amminoetilcarbammato)-D,L-aspartammide (PE) R1= mol 4-NFC/mol U.R. PHEA R2=mol EDA/mol U.R. PHEA DD in gruppi NH2 = 55 mol%

  44. X = 0.25 Film HA-PE EDC/NHSS 37°C Lavaggi in H2O X = 0.35 + vortex Y=1 X = 0.50 HA PE X = mol NH2 PE/mol U.R. HA Y = mol attivanti/mol NH2 PE Gel forming solutions (HA 3% p/v) Film polimerici compositi a base di HA e PE *EDC =1-etil-3-[3-(dimetilammino)propil]carbodiimmide NHSS= N-idrossisulfosuccinimide

  45. Film polimerici compositi a base di HA e PE HA 1376 cm-1 PE 1263 cm-1 network HA-PE • Analisi FT-IR • 1376 cm-1 C=O (HA) • 1263 cm-1 C-N ( PE)

  46. Film polimerici compositi a base di HA e PE q X Film HA-PE X=0.25 secco (a) e dopo 2 (b) e 5 minuti (c) in DPBS a 37°C • Studi di swelling Swelling ratio q = Ws/Wd dopo 48h in DPBS a pH 7.4, 37°C *X= mol NH2 PE/mol U.R. HA

  47. Film polimerici compositi a base di HA e PE Condizioni: 37°C, 150 rpm Metodo analitico: Saggio al carbazolo* *Bitter T., Muir H.M. Anal. Biochem. 4 (1962) 330-334 *X= mol NH2 PE/mol U.R. HA • Studi di idrolisi chimica (DPBS pH 7.4)

  48. Film polimerici compositi a base di HA e PE CBS pH 6.3 + HAase 75 U/ml + HAase 150 U/ml • Studi di idrolisi enzimatica (ialuronidasi) X  degradabilità L’ENTITÀ DELLA DEGRADAZIONE DIPENDE DAL RAPPORTO MOLARE PE/HA *X= mol NH2 PE/mol U.R. HA • Condizioni: 37°C, 150 rpm • Mezzo: soluzione tampone citrato a pH 6.3 (CBS) +/- HAase • Metodo analitico: Saggio al carbazolo* *Bitter T., Muir H.M. Anal. Biochem. 4 (1962) 330-334

  49. Film polimerici compositi a base di HA e PE Incubazione con campioni: 3-6 giorni Campioni: film HA-PE Incubazione con campioni: 3 giorni Campioni: MEM condizionato con i film HA-PE Condizionamento: 37°C,150 rpm Fibroblasti human derm incubati con i film HA-PE, dopo 1 giorno (a, 100X) e dopo 3 giorni (b, 400X; c, 100X). Controllo (d, 100X) • Studi biologici in vitro: citocompatibilità • “DIRETTA” Cellule:Fibroblasti human derm (1*105/ml) Mezzo di coltura:MEM (10% in FBS) Metodo di analisi:MTT assay • “INDIRETTA”

  50. Film polimerici compositi a base di HA e PE SISTEMI ANTI-ADESIONI INGEGNERIA TISSUTALE • Vitalità cellulare dopo adesione • Incubazione film HA-PE + fibroblasti human derm (1*104 cell/ml,MEM) per 3 giorni • Lavaggi (DPBS) e incubazione dei film in MEM fresco per 6 giorni • Saggio di vitalità cellulare (trypan blue) PE/HA  adesione cellulare più bassa % di PE più alta % di PE *X= mol NH2 PE/mol U.R. HA

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