ESTHER VENTIANE 2008 METHODE DE DIAGNOSTIC ET DE SUIVI DE L’INFECTION PAR LE VIH

1. Service de Microbiologie VIROLOGIE CHU saint Louis – Paris 10 francois.simon@sls.aphp.fr ESTHER VENTIANE 2008 METHODE DE DIAGNOSTIC ET DE SUIVI DE L’INFECTION PAR LE VIH

3. HIV-1 3 groupes HIV-2 HIV-1O HIV-1N HIV-1M K A J H A B (I) G B H F C C E D CRF04-cpx* D G (E) F virus mosaïques CRF01-AE* Plus de 30 formes recombinantes Diversité du VIH A B *

4. Quels sont les examens biologiques qui permettent de faire le diagnostic de l’infection à VIH-1 ELISA Test rapide

5. ELISA • Les tests ELISA sont dits « mixtes » lorsqu’ils détectent les anticorps anti-VIH1 et les anticorps anti-VIH2 de façon simultanée. • Ils sont dits combinés lorsqu’ils détectent, à la fois, les anticorps anti-VIH1 et VIH2 et l’antigène P24 du VIH1. • Ils sont dits de 1ère génération lorsque les antigènes utilisés étaient du lysat viral (abandonné en France hors recherche) • Test de 2ème génération : les tests utilisant des antigènes de synthèse soit par recombinants soit par peptides • Test de 3ème génération, il s’agit de tests par immuno-capture détectant à la fois les IgG et les IgM, les immunoglobulines étant pris en sandwich entre les antigènes de la phase solide et un antigène marqué servant pour révéler la liaison Ag-Ac-Ag • Test de 4ème génération, il s’agit des tests mixtes, et combinés, à haute sensibilité basée sur le principe de l’immunocapture et détectant les anticorps antiHIV1, antiHIV2 et l’antigène P24 à un seuil de détection de au moins 30- 50 pg/ml de sérum

6. diagnostic sérologique mixte 4eme Generation • Détection des anticorps • Totaux (IgG + IgM) • IgG ou IgM • Expression des résultats • Qualitatif (positif ; • négatif ; douteux) ELISA

7. Test ELISA indirect (Infection par le VIH) Microplaque ELISA : Les puits colorés correspondent à des positivités

8. Les tests par immunochromatographie ou TESTS RAPIDES L’antigène et le réactif de révélation sont fixés en même temps sur une membrane lors de la diffusion du sérum, les anticorps vont se fixer sur l’antigène et sur le réactif de confirmation et entraîner ce dernier vers un témoin sur le site de contrôle et qui donnera une réaction obligatoirement positive pour valider le test. Ces tests peuvent être utilisés avec le sérum, le plasma, parfois le sang total voire la salive.

9. TESTS RAPIDES & GENERATIONS DE TESTS • Les tests immuno-chromatographiques peuvent être considérés comme des tests de 3ème génération dans la mesure où certains d’entre eux peuvent désormais détecter les isotypes IgG et IgM. • Les tests TDR de 4ème génération sont actuellement en évaluation.

10. Western blot de confirmation (Infection par le VIH) Western Blot du VIH-1 • Bandelette 1 : Contrôle positif • Bandelette 2 : Contrôle négatif • Sérum A: Negatif • Sérum B: Indeterminé • Sérum C: Positif

12. Quels sont les marqueurs biologiques permettant le suivi clinique et thérapeutique des sujets infectés par VIH ?

13. Quantification ARN VIH-1 Charge virale ARN VIH-1 Plasma EDTA (LCR) Suivi biologique de l’infection à VIH-1

14. Extraction des ARN/ADN viraux • principales étapes : • lyse des virions • précipitation en présence d'éthanol • adsorption sur membrane ou billes de silica-gel • lavages puis élution de l'extrait

15. Extracteurs automatiques Extraction d’Acides Nucléiques Sang total, plasma LCR, LBA, biopsie... 200 µl 32 échantillons 2 heures Extracteur d’acides nucléiques Magna Pure LC (Roche)

16. Transcription inverse • certains virus d'intérêt médical majeur ont un génome ARN --> VIH, VHC … • transformation en ADN complémentaire (ADNc) par une transcriptase inverse (RT) : • plus stable chimiquement • obligatoire pour permettre une PCR

17. PCR en temps réel - Résultat

18. PCR versus PCR en Temps Réel Phase plateau Détection de la PCR traditionnelle 96 réplicats Fluorescence Phase exponentielle Détection de la PCR Temps Réel Phase d’initiation 5 10 15 20 25 30 35 40 Nb de cycles

19. Plateformes automatisées Extraction d’ARN/ADN et PCR en temps réel Roche Abbott Quantification ARN VIH-1, ADN VHB, ARN VHC

20. m2000sp Sérum Plasma Urine Sang total Buffy Coats Écouvillons LCR Salive Moelle Sperme Expectorations ARN viral ADN viral Bactérien Génomique

21. m2000rt • Rapide, analyse de données validée avec le logiciel de m2000rt Résultat détaillé de la série Résultat détaillé de l ’échantillon • Interface LIS • Marquage CE-IVDD • Logiciel de diagnostic convivial • Fonctionnement en mode ouvert pour autres tests Abbott (07/2006) • Technologie avancée et fiable • Technologie en temps réel • Camera CCD, Lecture de 5 filtres • Jusqu’à 96 échantillons

25. 1ère phase (T1/2 : 1 jour) 2ème phase (T1/2 : 14 jours) Réplication virale résiduelle Charge virale en ARN plasmatique Seuil de détection Virus issus du « réservoir » lymphocytaire Eradication ? Durée du traitement antirétroviral efficace (jours) Modélisation de la cinétique de décroissance de la charge virale plasmatique chez un patient qui débute un traitement antirétroviral efficace

26. RESISTANCE AUX ANTIRETROVIRAUX

27. Pourquoi y a t’il sélection de virus résistants ? • Taux d’erreur de la TI: 1/10.000 nucléotides • Production virale: 109-1010 particules par jour • Toutes les mutations pré-existent avant traitement • Taux de recombinaison: 5 à 10 évènements par cycle • Evolution constante de la quasiespèce • Demie-vie d’un virus plasmatique = 0.3 jours • Demie-vie des cellules infectées = 2.2 jours

28. Emergence de virus résistants • En l’absence d’antirétroviral • Le virus sauvage est le plus adapté, c’est le variant le plus prévalent dans la quasiespèce virale réplicative • Sous pression de sélection antirétrovirale • Les variants résistants émergent en raison de leur avantage réplicatif dans ces conditions Pression de sélection

29. Pression de sélection antirétrovirale Variants sensibles Variants résistants Début du traitement Sélection de variants résistants Charge virale • Suppression incomplète • Défaut de puissance • Taux plasmatiques insuffisants • Défaut d’observance • Pré-existence de résistance Temps

30. Mutations de résistance • Présentes dans les gènes cibles des antirétroviraux : -->TI, protéase, gp41, intégrase • Elles confèrent un avantage réplicatif aux virus en présence de drogues : -->sélection de variants mutés • Certaines ont un effet négatif sur la fonction de l’enzyme M184V (sauvage) position (muté)

31. Génotype de résistance -VIH1 • Analyse des mutations des gènes RT, protéase, gp 41 VIH-1 associées à la résistance aux traitements antirétroviraux Choix du premier traitement Gestion des échecs virologiques

32. Génotype de résistance -VIH1(ANRS consensus, tous les gènes cibles des antirétroviraux) ARN viral Purification produits PCR Extraction cDNA Plasma PCR nichée Séquence Séquences gènes RT, protéase (gp41, intégrase) Purification C C T CCGGAAGATGGGTTGGGGA Séquence nucléotidique Migration sur séquençeur

34. INDICATIONS DES TESTS DE RESISTANCE • RECOMMANDE • Primo-infection • Dés le diagnostic ou avant initiation du traitement • Tous les échecs thérapeutiques (réplication virale sous traitement) • Grossesse • Nouveau-né • Enfant (diagnostic et échec)