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Marçal Pastor-Anglada

BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A LA QUIMIOTERAPIA Y ANÁLISIS FARMACOGENÓMICO DE DIANAS INTRACELULARES. Marçal Pastor-Anglada. DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR, UNIVERSIDAD DE BARCELONA. CURSO DE POST-GRADO EN GENÓMICA Y PROTEÓMICA 10 de Febrero de 2005.

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Marçal Pastor-Anglada

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  1. BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A LA QUIMIOTERAPIA Y ANÁLISIS FARMACOGENÓMICO DE DIANAS INTRACELULARES Marçal Pastor-Anglada DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR, UNIVERSIDAD DE BARCELONA CURSO DE POST-GRADO EN GENÓMICA Y PROTEÓMICA 10 de Febrero de 2005

  2. MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS ASPECTOS BÁSICOS DE LOS TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS (NTs) FARMACOLOGÍA DE LOS NTs PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS ANÁLISIS FARMACOGENÓMICO DE LA ACCIÓN DE FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS

  3. QUIMIOTERAPIA. MECANISMOS DE ACCIÓN Mayoritarimente análogos de nucleósidos. Antimetabolitos Interferencia en la síntesis de nucleótidos. Acción en fase S. Incorporación a DNA y RNA. Reparación---Radiosensibilización Integridadmitocondrial Arresto en ciclo o muerte por apoptosis. Adaptado de Pastor-Anglada et al., Trends in Pharmacological Sciences 19:424.430, 1998

  4. -P -PP N N N N H H H H N H 2 2 2 2 2 H H H H N N N N H N O O O O N N N N O N H H H H H O O O O O O O O O O F F F F F H H H H O O O O H O F F F F F -PPP GEMCITABINA. MECANISMO DE ACCIÓN dFdC Desfosforilada por la 5’-NT I Fosforilada por la dCK y TK2 dFdCMP dCDA dCMPdA Quinasas Detoxificación a dFdUMP y dFdU dFdCDP Quinasas dFdCTP

  5. Inhibición de la citidina desaminasa y la dCDA. Inhibición de la timidilato sintasa. dFdC Inhibición de la citidina desaminasa y la dCDA. dFdCMP -P Inhibición de la ribonucleótido reductasa. dFdCDP -PP N N N N H H H H N H 2 2 2 2 2 H H H H N N N N H N O O O O N N N N O N H H H H H O O O O O O O O O O Incorporación a DNA y RNA dFdCTP F F F F F H H H H O O O O H O F F F F F -PPP Radiosensibilización GEMCITABINA. MECANISMO DE ACCIÓN

  6. NH2 NH2 NH2 F F F H H H N N N O O O NH NH NH O O F F H H N N O O NH NH DIANAS DEL 5-FU Inhibición TS Incorporación a RNA y DNA CAPECITABINA. MECANISMO DE ACCIÓN N4-pentyloxycarbamyl-5’-deoxy-5-fluorocytidine Capecitabina Carboxil esterasa 5’-deoxy-5-fluorocytidine 5’-DFC Citidina desaminasa 5’-DFUR 5’-deoxy-5-fluorouridine Timidina fosforilasa 5-FU 5-fluorouracilo

  7. dCK Disminución de la actividad causa resistencia TK2 Baja actividad aumenta la sensibilidad debido a que fosforila más eficientemente el nucleósido natural dCyd 5’-NT La sobreexpresión causa resistencia al desfosforilar los nucleótidos a nucleósidos RR Un aumento de la actividad o falta de inhibición de la ribonucleótido reductasa causa resistencia a gemcitabina. EJEMPLOS DE MECANISMOS DE RESISTENCIA A FLUOROPIRIMIDINAS RESISTENCIA A GEMCITABINA. METABOLISMO

  8. TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS Metabolismo intracelular. Proteínas de la familia Bcl-2. DNA y RNA polimerasas. Caspasa 8. Vía PI3’K. Mutaciones en el gen p53. NUEVOS ELEMENTOS IMPLICADOS EN LAS BASES MOLECULARES DE LA RESISTENCIA A LA QUIMIOTERAPIA RESISTENCIA A GEMCITABINA: TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS??

  9. MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS ASPECTOS BÁSICOS DE LOS TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS (NTs) FARMACOLOGÍA DE LOS NTs PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS ANÁLISIS FARMACOGENÓMICO DE LA ACCIÓN DE FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS

  10. S Na IN OUT S S Na S S S Mecanismos de transporte de nucleósidos al interior de la célula ENT Equilibrative Nucleoside Transporter CNT Concentrative Nucleoside Transporter IN OUT UP-HILL DOWN-HILL

  11. 8 1 2 3 4 5 6 7 9 10 11 Uridine Uridine PROTEIN GENE LENGTH IDENTITY INHIBITORS (IC ) SUBSTRATES (Km) TISSUE DISTRIBUTION 50 hENT1 SLC29A1 456 50% NBTI 0.4nM Dip 5nM U 0.26mM A 0 .04mM Ubiquitous, plasma, perinuclear I 0.17mM C 0.58mM and mitochondrial membranes m hENT2 SLC29A2 456 NBTI 2.8 M Dip 356nM U 0.25mM A 0.14mM Ubiquitous, highly abundant es ei I 0.05mM C 5.61mM in skeletal muscle Nuclebases (hypoxanthine) ENT1 ENT2 ENTs (SLC29), transportadores de baja afinidad y amplia selectividad Pastor-Anglada, M.; Baldwin, S.A. Drug Development Research 52:431-437, 2001 hENT family CO2- NBTI NH3+

  12. CO2- PROTEIN GENE LENGTH IDENTITY STOICHIOMETRY SUBSTRATES ( Km) TISSUE DISTRIBUTION m m hCNT1 SLC28A1 650 72% and 48% 1-2Na/1Nucleoside U 40-60 M T 6 M Most epithelia, macrophages, (kidney, intestine) m C 34 I n.t. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 m m hCNT2 SLC28A2 658 47% 1Na/1Nucleoside U 80 M I 4.5 M Epithelia (liver), macrophages,brain, ilots, B,T cells, brain,heart,skel.muscle 8 2 m A 8 M T n.t. m m hCNT3 SLC28A3 691 2Na/1Nucleoside U 22 M T 21 M Widely distributed, not solved yet at the protein level m m I 53 M A 15 M Na Uridine NH3+ N CNT 1-3 CNTs (SLC28), transportadores de alta afinidad, relativamente específicos Pastor-Anglada, M.; Baldwin, S.A. Drug Development Research 52:431-437, 2001 hCNT family

  13. Barrett and Grisham, 1995 Biochemistry Vias biosintéticas: LOS NUCLEÓSIDOS SON MOLÉCULAS CARAS Algunos tipos celulares, especialmente aquellos de alto recambio, dependen esencialmente de las vías de “recuperación” -ENTEROCITOS -CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNE

  14. Los transportadores de nucleósidos en la naturaleza Los CNTs humanos y de mamíferos tienen ortólogos en nemátodos, insectos, protozoos, levaduras, bacterias,.... La vía de recuperación está altamente conservada Role of nucleoside transporters SLC28 and SLC29 in cancer chemotherapy. Pastor-Anglada, M., Casado, F.J., en Deoxynucleoside analogs in cancer therapy (Peters, G.J., editor) Cancer Drug Discovery and Development book series. The Humana Press, Inc.Totowa, New Jersey, en prensa

  15. Procesos celulares en los que los nucleós(t)idos están involucrados -Precursores de ácidos nucléicos (ARN y ADN) -Activadores en vías biosintéticas (p.e. UDP) -Unidades de transferencia de energía (ATP,GTP) -Coenzimas (NAD, FAD) -Moduladores de la fisiología celular (cAMP, ATP, Ado) La base de la quimioterapia radica en el aprovechamiento de las vías de recuperación de aquellas células que presentan elevados índices de proliferación

  16. MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS ASPECTOS BÁSICOS DE LOS TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS (NTs) FARMACOLOGÍA DE LOS NTs PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS ANÁLISIS FARMACOGENÓMICO DE LA ACCIÓN DE FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS

  17. LA GEMCITABINE (GEMZAR), PERO NO LA FLUDARABINA, ES UN SUBSTRATO CAPTADO CON ALTA AFINIDAD APARENTE POR EL TRANSPORTADOR hCNT1 EJEMPLO DE SISTEMAS HETERÓLOGOS DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS PARA DEFINIR PERFILES FARMACOLÓGICOS Lostao, M.P., Mata, J.F., Larrayoz, I.M., Inzillo, S.M., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M. FEBS Letters 481:137-140, 2000

  18. K 0.5 (mM) % corriente uridina 0.5mM Uridine 37±7 (8) 100 (8) Cytidine 29±8 (6) 47±7 (6) Thymidine 26±7 (4) 109±19 (4) Gemcitabine 18±5 (8) 33±5 (8) 5’-DFUR 245±39 (7) 147±18 (7) Vh=-50 mV Larráyoz, I.M., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M., Lostao, M.P.Journal Biological Chemistry 279:8999-9007, 2004.

  19. La capecitabina (Xeloda) es un profármaco oral de última generación utilizado en el tratamiento de tumores de colon y mama Carboxilesterasa 5’-desoxi-5-fluorocitidina Capecitabina HÍGADO HÍGADO - TUMORES? Citidina desaminasa 5’-desoxi-5-fluorouridina (5-DFUR) TImidina Fosforilasa TUMORES 5-fluorouracilo 5-DFUR, EL INTERMEDIARIO INMEDIATO DE 5-FU EN TUMORES, ES SUBSTRATO DEL TRANSPORTADOR CONCENTRATIVO DE ALTA AFINIDAD hCNT1 Mata, J.F., García-Manteiga, J.M., Lostao, M.P., Fernández-Veledo, S., Guillén-Gómez, E., Larrayoz, I.M., Lloberas, J., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M. Molecular Pharmacology 59:1542-1548, 2001

  20. CHO wt CHO-vector CHO-hCNT1 La expresión heteróloga de hCNT1 confiere sensibilidad a 5-DFUR, independientemente de las actividades equilibrativas endógenas. -dipyridamol +dipyridamol Mata, J.F., García-Manteiga, J.M., Lostao, M.P., Fernández-Veledo, S., Guillén-Gómez, E., Larrayoz, I.M., Lloberas, J., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M. Molecular Pharmacology 59:1542-1548, 2001

  21. CÉLULAS TUMORALES PANCREÁTICAS. SENSIBILIDAD A GEMCITABINA EFECTO DE LA REINTRODUCCIÓN DE hCNT1 SOBRE LA ACCIÓN CITOTÓXICA DE LA GEMCITABINA PC1 NP-9 HC1 TANTO EN UNA EXPOSICIÓN A GEMCITABINA COMO EN UN PROTOCOLO DE TRIPLE EXPOSICIÓN AL FÁRMACO, LA PRESENCIA DE hCNT1 SENSIBILIZÓ LAS CÉLULAS AL TRATAMIENTO CON EL FÁRMACO ENSAYO DE CITOTOXICIDAD DE GEMCITABINA EN LOS CLONES DE NP-9 72 H DESPUÉS DE 90 MINUTOS DE INCUBACIÓN AL FÁRMACO García-Manteiga, J., Molina-Arcas, M., Casado, F.J., Mazo, A., Pastor-Anglada, M. Clinical Cancer Research9:5000-5008, 2003

  22. AZT d4T 5-DFUR Thymidine 3tC Gemcitabine Cytidine ddC IC50 (M) Km (M) Cytidine 4.5±0.2 3.1±0.7 Thymidine 12.55±1.93 ND AZT 1004±150 963±135 d4T 4525±301 15600±4700 ddC 5730±222 NT 3tC >>20000 NT Gemcitabine ND 17±2 5-DFUR ND 209±51 Cano-Soldado, P., Larráyoz, I., Molina-Arcas, M., Casado, F.J., Martínez-Picado, J., Lostao, M.P., Pastor-Anglada, M. Antiviral Therapy 9:993-1002, 2004

  23. Selectividad farmacológica de hCNT1 Cano-Soldado, P., Larráyoz, I., Molina-Arcas, M., Casado, F.J., Martínez-Picado, J., Lostao, M.P., Pastor-Anglada, M. Antiviral Therapy 9:993-1002, 2004 Cytidine 2’-deoxycytidine ddC

  24. Perfiles farmacológicos preliminares de los transportadores hCNT y hENT Deoxynucleoside transporters in cancer therapy. Pastor-Anglada, M., Casado, F.J. En Deoxynucleoside Analogs in Cancer Therapy (Peters, G.J., editor) Cancer Drug Discovery and Development book series. The Humana Press, Inc. Totowa, New Jersey. En prensa Pastor-Anglada, M., Molina-Arcas, M., Casado, F.J., Bellosillo, B., Colomer, D., Gil, J. Leukemia 18:385-393, 2004

  25. MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS ASPECTOS BÁSICOS DE LOS TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS (NTs) FARMACOLOGÍA DE LOS NTs PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS ANÁLISIS FARMACOGENÓMICO DE LA ACCIÓN DE FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS

  26. CNT2 ENT1 ENT2 LOS TRANSPORTADORES SON PRACTICAMENTE UBICUOS Y SU EXPRESIÓN ESTÁ ALTAMENTE CONDICIONADA POR EL ESTADO DE DIFERENCIACIÓN CELULAR La expresión de estas proteínas es prácticamente ubicua o muy amplia Valdés, R., Ortega, M.A., Casado, F.J., Felipe, A., Gil, A., Sánchez-Pozo, A., Pastor-Anglada, M. Gastroenterology 119:1623-1630, 2000 Las células de hepatoma presentan un perfil diferente de expresión de CNT y ENT. del Santo, B., Valdés, R., Mata, J.F., Felipe, A., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M. Hepatology 28:1504-1511, 1998 La diferenciación de hepatocitos fetales con dexametasona induce CNT2. Del Santo, B., Tarafa, G., Felipe, A., Casado, F.J., Pastor-Anglada, M. Journal of Hepatology 34:873-880, 2001

  27. ¿PERO SE OBSERVA REALMENTE UNA PÉRDIDA DE EXPRESIÓN DE TRANSPORTDAORES CNT EN MODELOS IN VIVO? HEPATOCARCINOGÉNESIS INDUCIDA QUÍMICAMENTE Dragan, Y., Valdés, R., Gómez-Angelats, M., Felipe, A., Casado, F.J., Pitot, H.C., Pastor-Anglada, M. Hepatology 32:239-246, 2000 H&E G-6Pasa GSTp rCNT2

  28. SE DEMUESTRA POR PRIMERA VEZ LA PÉRDIDA DE EXPRESIÓN DE UN TRANSPORTADOR DE LA FAMILIA GÉNICA CNT1 EN UN MODELO ANIMAL DE CÁNCER MODELO DE RATA TRANSGÉNICA Alb-SV40 Dragan, Y., Valdés, R., Gómez-Angelats, M., Felipe, A., Casado, F.J., Pitot, H.C., Pastor-Anglada, M. Hepatology 32:239-246, 2000 H&E G-6Pasa T-SV40 rCNT1

  29. PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS evidencias de expresión diferencial de NTs en tumores primeros estudios clínicos (tumores sólidos y enfermedades linfoproliferativas)

  30. CÉLULAS TUMORALES PANCREÁTICAS. EXPRESIÓN DE TRANSPORTADORES ANALISIS POR RT-PCR DE LA EXPRESIÓN DE hENT1, hENT2, hCNT1, hCNT2 y hCNT3 EN NPs LAS CUATRO LÍNEAS MUESTRAN ALTOS NIVELES DE mRNA DE hENT1 TAMBIEN SE DETECTA, AUNQUE EN MENOR MEDIDA EL mRNA DE hENT2 A PESAR DE LA AUSENCIA DE ACTIVIDAD CONCENTRATIVA DETECTADA EN LOS ENSAYOS DE TRANSPORTE TODAS LAS LÍNEAS NP EXPRESAN EL mRNA DE UNO O MÁS TRANSPORTADORES CONCENTRATIVOS. García-Manteiga, J., Molina-Arcas, M., Casado, F.J., Mazo, A., Pastor-Anglada, M. Clinical Cancer Research, 9:5000-5008, 2003

  31. PANEL DE ANTICUERPOS DESARROLLADOS CONTRA TRANSPORTADORES NT M.Pastor Anglada, F.J.Casado Merediz, A.Felipe Campo, Method and in vitro kit for selecting a drug for chemotherapy WO 00/52477 Balagué Center, S.A.Países: ESTADOS UNIDOS DE AMERICA ; JAPON ; CANADA ; UNIÓN EUROPEA ICC IHC western

  32. Tongue Lung Kidney Uterus Liver Breast Matrices de tejidos “Tissue array” • Analisis simultáneo de muchas muestras • Cilindros adecuados para IHQ • 2 mm................60 muestras • 1.5 mm.......... 135 • 1 mm............. 200 • Controles positivos y negativos internos • Tinción homogénea • Eficiente y rápido

  33. A B C hCNT1 hENT1 hENT2 C E D hCNT1 hENT1 hENT2 F G hCNT1 hCNT1 PATRONES DE EXPRESIÓN DE TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS EN TUMORES GINECOLÓGICOS Expression of the nucleoside-derived drug transporters hCNT1, hENT1 and hENT2 in gynecological tumors. Farré,X..,Guillén-Gómez,E.,Sánchez, Hardisson, D., Plaza, Y., Lloberas, J., Casado, F.J., Palacios, J., Pastor-Anglada, M. International Journal of Cancer112:959-966, 2004

  34. Ovarian carcinomas Expression - + ++ hENT1 (n =90) 8 (8.8 %) 41 (45.6 %) 41 (45.6 %) hENT2 (n= 89) 14 (15.7 %) 54 (60.7 %) 21 (23.6 %) hCNT1 (n = 90) 30 (33.3 %) 45 (50.0 %) 15 (16.7 %) Endometrial carcinomas Expression - + ++ hENT1 (n = 80) 0 (0 %) 27 (33.8 %) 53 (66.2 %) hENT2 (n = 78) 0 (0 %) 47 (60.3 %) 31 (39.7 %) hCNT1 (n = 79) 12 (15.2 %) 60 (75.9 %) 7 (8.9 %) Uterine cervix carcinomas Expression - + ++ hENT1 (n = 117) 5 (4.2 %) 63 (53.9 %) 49 (41.9 %) hENT2 (n = 117) 2 (1.7 %) 55 (47.0 %) 60 (51.3 %) hCNT1 (n = 118) 46 (39.0 %) 33 (28.0 %) 39 (33.0 %) SEMI-CUANTIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS NT EN TUMORES GINECOLÓGICOS Expression of the nucleoside-derived drug transporters hCNT1, hENT1 and hENT2 in gynecological tumors. Farré,X..,Guillén-Gómez,E.,Sánchez, Hardisson, D., Plaza, Y., Lloberas, J., Casado, F.J., Palacios, J., Pastor-Anglada, M. International Journal of Cancer112:959-966, 2004

  35. Expression of hCNT1 in uterine cervix carcinomas by hystologic type Hystologic type Expression Expression of hCNT1 in ovarian carcinomas by hystologic type p = 0.016 - + / ++ (%) Hystologic type Expression Adenocarcinoma 35 29 45.3 - + / ++ (%) Squamous cell 11 43 79.6 Serous 6 25 80.6 Mucinous 5 9 64.3 Endometrioid 1 9 90.0 Clear cell 18 17 48.6 p < 0.001 LA PÉRDIDA DE LA EXPRESIÓN DE hCNT1 SE ASOCIA CON SUBTIPOS HISTOLÓGICOS CONCRETOS DE TUMORES GINECOLÓGICOS Expression of the nucleoside-derived drug transporters hCNT1, hENT1 and hENT2 in gynecological tumors. Farré,X..,Guillén-Gómez,E.,Sánchez, Hardisson, D., Plaza, Y., Lloberas, J., Casado, F.J., Palacios, J., Pastor-Anglada, M. International Journal of Cancer112:959-966, 2004

  36. PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS evidencias de expresión diferencial de NTs en tumores primeros estudios clínicos (tumores sólidos y enfermedades linfoproliferativas)

  37. 2-fluoroadenine-9--D-arabinofuranoside La sensibilidad ex-vivo a la fludarabina se correlaciona con el transporte del fármaco mediado por proteínas ENT, pero no guarda correlación con sus niveles de ARNm p=0.029 r=0.488 p=0.006 r=0.591 Molina-Arcas, M., Bellosillo, B., Casado, F.J., Montserrat, E., Gil, J., Colomer, D., Pastor-Anglada, M. Fludarabine uptake mechanisms in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood 101:2328-2334, 2003

  38. ENT1 AND ENT2 PROTEIN EXPRESSION IN CLL PATIENTS Equilibrative Nucleoside Transporter-2 (hENT2) Protein correlates with ex-vivo Sensitivity to Fludarabine in Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL)-cells. Molina-Arcas, M., Marcé, S., Villamor, N., Huber-Ruano, I., Casado, F.J., Bellosillo, B., Montserrat, E., Gil, J., Colomer, D., Pastor-Anglada, M. Leukemia 19:64-68, 2005

  39. LA PROTEINA hENT2 COMO BIOMARCADOR DE LA RESPUESTA A LA FLUDARABINA EN ENFERMOS DE LLC p= 0.1206 r = 0.379 p= 0.0258 r = 0.538 p= 0.0060 r = 0.693 p= 0.0465 r = 0.475 Equilibrative Nucleoside Transporter-2 (hENT2) Protein correlates with ex-vivo Sensitivity to Fludarabine in Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL)-cells. Molina-Arcas, M., Marcé, S., Villamor, N., Huber-Ruano, I., Casado, F.J., Bellosillo, B., Montserrat, E., Gil, J., Colomer, D., Pastor-Anglada, M. Leukemia 19:64-68, 2005

  40. LA AUSENCIA DE hENT1 SE ASOCIA CON UNA MENOR SUPERVIVENCIA EN PACIENTES CON ADENOCARCINOMA PANCREÁTICO TRATADOS CON GEMCITABINA The absence of human equilibrative nucleoside transporter 1 is associated with reduced survival in patients with gemcitabine-treated pancreas adenocarcinoma Spratlin,J., Sangha, R., Glubrecht, D., Dabbagh, L., Young, J.D., Dumontet, C., Cass, C., Lai, R., Mackey, R..Clinical Cancer Research 10:6956-6961, 2004

  41. CONCLUSIONES 1.-EL PATRÓN DE EXPRESION DE LAS PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS CNT Y ENT PUEDE TENER RELEVANCIA DIAGNÓSTICA, AUNQUE ANTICIPAMOS QUE SERÁ VARIABLE EN FUNCIÓN DEL TIPO DE TUMOR. 2.-ES FUNDAMENTAL ANALIZAR ESTOS PATRONES DE EXPRESIÓN EN TUMORES SÓLIDOS DE ENFERMOS QUE ESTÉN BAJO UNA TERAPIA CON DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS. 3.-LA POSIBILIDAD DE REGULAR FARMACOLÓGICAMENTE LA FUNCIÓN DE ESTAS PROTEÍNAS TAMBIEN SE APUNTA COMO UNA APLICACIÓN TERAPÉUTICA COADYUVANTE, AL PODER EVENTUALMENTE MODULAR LA BIOASEQUIBILIDAD DE FÁRMACOS.

  42. MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS ASPECTOS BÁSICOS DE LOS TRANSPORTADORES DE NUCLEÓSIDOS (NTs) FARMACOLOGÍA DE LOS NTs PATRONES DE EXPRESIÓN DE NTs E IMPLICACIONES CLÍNICAS ANÁLISIS FARMACOGENÓMICO DE LA ACCIÓN DE FÁRMACOS DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS

  43. OBJETIVO Utilizar la técnica de microarrays de DNA para:  Profundizar en las bases moleculares de la acción farmácológica de los análogos de nucleósidos Efecto del 5’DFUR en células MCF7 (tumor de mama)  Estudiar el papel de los transportadores de nucleósidos en la acción de los análogos de nucleósidos Inhibición del transportador ENT1 con NBTI

  44. Caracterización de la línea MCF7 Expresa los cinco transportadores de nucleósidos Presenta únicamente transporte equilibrativo, principalmente ENT1 5’DFUR es transportado mayoritariamente a través de ENT1 Citotoxicidad de 5’DFUR • 90 minuto de tratamiento • Medida por contaje celular • +/- NBTI 100nM

  45. CONDICIONES ELEGIDAS PARA LOS ESTUDIOS FARMACOGENÓMICOS • 5’-DFUR 250 M  NBTI  IC75 + NBTI  IC50  90 minutos de tratamiento  +/- NBTI 100 nM (pre-incubación 30 min)  Efecto a tiempos cortos 4h y a tiempos largos 24h 8 condiciones experimentales • control • NBTI 100nM 4 y 24 horas postratamiento • 5’-DFUR 250M • 5’-DFUR 250M + NBTI 100nM arrays • 2 experimentos independientes • marcaje Cy3 y Cy5 32 arrays

  46. 5’DFUR 5’DFUR+NBTI ctrl NBTI G0/G1- 51% S- 34% G2- 16% G0/G1- 42% S- 36% G2- 22% G0/G1- 52% S- 33% G2- 15% G0/G1- 41% S- 36% G2- 23% 4h G0/G1- 54% S- 25% G2- 21% G0/G1- 50% S- 26% G2- 23% G0/G1- 42% S- 38% G2- 19% G0/G1- 53% S- 24% G2- 21% 24h EFECTO DEL TRATAMIENTO CON 5’DFUR Y DE LA INHIBICIÓN FARMACOLÓGICA DEL TRANSPORTADOR hENT1 SOBRE EL CICLO CELULAR

  47. 1- Obtención y amplificación de RNA 2- Síntesis y marcaje del cDNA 3 – Hibridación de los arrays (respecto a un control universal) 4- Scanning 5- Cuantificación de las señales de hibridación: Gene pix 6- Obtención de datos ONCOCHIP-CNIO >27.000 SPOTS >12.000 GENES Descartar las columnas que no interesan. Nos quedamos (por ejemplo) con: • Flag • Bloque • Columna • Fila • Nombre • ID • Media F635 • Mediana B635 • Media F532 • Mediana B532 ANÁLISIS INFORMÁTICO Role of hENT1 in fluropyrimidine-induced gene expression in breast cancer cells. Molina-Arcas, M., Moreno-Bueno, G., Hernández, H.L., Casado, F.J., Palacios, J., Pastor-Anglada, M., submitted

  48. 94ºC --- 5 min 94ºC --- 5 s 55ºC --- 30 s 72ºC --- 30 s 72ºC --- 7 min 30 ciclos 1,25 2,5 5 10 Amplificación del gen de interés conjuntamente con el control endógeno (GAPDH) Muy complicado amplificar el gen sin saturar la GAPDH Hacemos - cada gen por separado - cada condición por duplicado - + - + GAPDH RRM2B PLK2 RT-PCR semicuantitativa Diseñar primers de los genes a validar • Análisis de homologia con isoformas de la misma familia - Control endógeno GAPDH (banda 175pb) Buscar para cada gen condiciones no saturantes

  49. 24 horas 4 horas CTRL NBTI 5’DFUR 5’DFUR+N CTRL NBTI 5’DFUR 5’DFUR+N PLK2 TP53I3 RRM2B AQP3 TP53INP1 GAPDH RT-PCR semicuantitativa

  50. Real-time PCR  RNA Arrays  RNA amplificado Hemos perdido información al amplificar el RNA? Real-time PCR: FAS y p21

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