Techniques d immunomarquage en microscopie lectronique

38. Exemple d�une immunor�action ��sandwich�� en 4 �tapes avec application successive : 1 � de l�anticorps primaire 2 � d�un anticorps secondaire, ajout� en concentration �lev�e de fa�on � ce que cet anticorps se fixe pr�f�rentiellement par un seul ��bras�� sur l�anticorps primaire, laissant l�autre bras capable de fixer l�anticorps tertiaire 3 � un anticorps tertiaire dirig� contre le traceur 4 � le traceur (enzyme, fluorochrome �)? NB : l�anticorps secondaire doit �tre capable de lier les anticorps 1 et 3 : on utilisera le plus souvent des anticorps produits chez la m�me esp�ce. Dans le cas o� ces anticorps sont d�esp�ces diff�rentes on peut les ponter par la prot�ine A ou G (voir plus loin). Ce sch�ma r�actionnel g�n�ral est peu utilis�. Les variantes ci-apr�s sont plus courantes. Exemple d�une immunor�action ��sandwich�� en 4 �tapes avec application successive : 1 � de l�anticorps primaire 2 � d�un anticorps secondaire, ajout� en concentration �lev�e de fa�on � ce que cet anticorps se fixe pr�f�rentiellement par un seul ��bras�� sur l�anticorps primaire, laissant l�autre bras capable de fixer l�anticorps tertiaire 3 � un anticorps tertiaire dirig� contre le traceur 4 � le traceur (enzyme, fluorochrome �)? NB : l�anticorps secondaire doit �tre capable de lier les anticorps 1 et 3 : on utilisera le plus souvent des anticorps produits chez la m�me esp�ce. Dans le cas o� ces anticorps sont d�esp�ces diff�rentes on peut les ponter par la prot�ine A ou G (voir plus loin). Ce sch�ma r�actionnel g�n�ral est peu utilis�. Les variantes ci-apr�s sont plus courantes.

39. Dans le cas o� l�anticorps primaire et l�anticorps marqu� ne peuvent �tre reconnus par le m�me anticorps de pontage (esp�ces trop �loign�es) ont pourra r�aliser le pontage par la prot�ine A ou la prot�ine G. NB : 1 - les prot�ines A et G ne reconnaissent pas tous les anticorps avec la m�me affinit� : il existe des diff�rences importantes entre les affinit�s pour des anticorps de diff�rentes esp�ces animales ainsi que pour diff�rents isotypes chez une m�me esp�ce 2 � Il y a 5 sites de liaison des Ig sur chaque prot�ine A ou G : l�utilisation de prot�ine A ou G doit en principe pouvoir r�sulter en une immunor�action plus intense que celle obtenue en utilisant des immunoglobulines comme r�actif de pontage.Dans le cas o� l�anticorps primaire et l�anticorps marqu� ne peuvent �tre reconnus par le m�me anticorps de pontage (esp�ces trop �loign�es) ont pourra r�aliser le pontage par la prot�ine A ou la prot�ine G. NB : 1 - les prot�ines A et G ne reconnaissent pas tous les anticorps avec la m�me affinit� : il existe des diff�rences importantes entre les affinit�s pour des anticorps de diff�rentes esp�ces animales ainsi que pour diff�rents isotypes chez une m�me esp�ce 2 � Il y a 5 sites de liaison des Ig sur chaque prot�ine A ou G : l�utilisation de prot�ine A ou G doit en principe pouvoir r�sulter en une immunor�action plus intense que celle obtenue en utilisant des immunoglobulines comme r�actif de pontage.

40. Le marqueur (complexe anticorps-traceur) peut �tre pr�par� � l�avance ce qui permet �galement de r�duire le nombre d��tapes r�actionnelles � 3. C�est le cas du complexe PAP popularis� par LA Sternberger et coll. et tr�s couramment utilis�. Des complexes peuvent �tre r�alis�s avec d�autres traceurs. A notre connaissance seul le complexe APAAP (Alcaline Phosphatase Anti- Alcaline Phosphatase) est actuellement commercialis�.Le marqueur (complexe anticorps-traceur) peut �tre pr�par� � l�avance ce qui permet �galement de r�duire le nombre d��tapes r�actionnelles � 3. C�est le cas du complexe PAP popularis� par LA Sternberger et coll. et tr�s couramment utilis�. Des complexes peuvent �tre r�alis�s avec d�autres traceurs. A notre connaissance seul le complexe APAAP (Alcaline Phosphatase Anti- Alcaline Phosphatase) est actuellement commercialis�.