Genetička osnova i molekularna dijagnostika mišićnih distrofija

1. Genetička osnova i molekularna dijagnostika mišićnih distrofija Doc. dr. Emina Kiseljaković specijalista medicinske biohemije Laboratorij za molekularnu medicinu Medicinski fakultet u Sarajevu

2. Duchenne i Becker-ova mišićna distrofija (DMD i BMD) • genski defekti na najvećem genu (79 egzona, 2.5 Mbp) lociranom na kratkom kraku Xp21.1 hromozoma, gen kodira distrofin (427kDa). • Genetičke karakteristike: kod najvećeg broja pacijenata u genu za distrofin se nađu delecije ili duplikacije jednog ili više egzona. Mogu se naći tačkaste mutacije i male delecije i insercije. • Fenotipske karakteristike: teški oblik DMD - rano javljanje, progresivna bolest, visoke vrij. kreatinina u serumu i gotovo potpuno odsustvo (<2%) distrofina u mišićnim ćelijama. • Blagi oblik BMD – detektira se distrofin, fenotipski se javlja protein sa poremećenom slabijom funkcijom i veličinom.

3. 60 % 40 20 Delecije Duplikacije Tačkaste mutacije DMD – tipovi mutacija 60-65% 25-35% 5-10% BMD - do 85%

4. 1 10 20 30 40 50 60 70 Delecije na genu za distrofin tzv.”hot spots” mjesta “pokrivaju” ~98% svih delecija. BMD Intermed. DMD 3' 5' Egzoni Najčešća delecija DMD je out-of-frame delecija egzona 45

5. Duplikacije na genu za distrofin Distribucija duplikacija na genu za distrofin. Oko 80% duplikacija je smješteno na 5’ kraju, a oko 20% u centralnoj regiji gena. J Mol Diagn. 2005; 7(3): 317–326.

6. Male mutacije na genu za distrofin Distribucija malih mutacija (tačkaste mutacije, male delecije i duplikacije na genu za distrofin. Nasumičan raspored duž cijelog gena. J Mol Diagn. 2005 ; 7(3): 317–326.

7. Promjena okvira čitanja i prijevremeno prekidanje translacije – out of frame mutacija kod DMD.

8. Molekularna dijagnostika DMD gena • Minimalni nivo dijagnostičkog testiranja - skrining većine delecija egzona. Bazična metoda je mutliplex PCR . Ovom metodom se otkrivaju najčešće delecije. • Prednost metode, relativna jednostavnost, ali ne otkriva velike duplikacije, male delecije ili insercije, tačkaste mutacije niti se može kosititi za testiranje žena nosioca. • Negativan test ne isključuje dijagnozu DMD ili BMD, obzirom da 15-35% mutacija nisu delecije • Za identifikaciju duplikacija (~5% pacijenata) ili za dalju karakterizaciju delecija koristi se kvantitativni multipleks PCR. for -prajmeri su fluorescentno obilježeni - automatski sekvencer vrši detekciju i kvantifikaciju PCR produkata. Napokon za dalju identifikaciju mutacije gena se koristi Southern blot analiza.

9. Molekularna dijagnostika DMD gena Southern blot – direktna detekcija delecija i duplikacija. Dijagnoza, detekcija nositelja, genetsko savjetovanje Ako nije otkrivena delecija ili duplikacija kod pacijenata treba uraditi sekvenciranje. • MLPA –multiplex ligation-dependent probe amplification - kvantitativna analiza delecija i duplikacija svih egzona • array-CGH – oligonucleotide-based array comparative genomic hybridisation - analiza broja kopija varijacija cijelog gena. • 2% slučajeva sa kompleksnim rearanžmanima i dubokim intronskim promjenama koje se ne detektiraju analizom genomske DNA J Mol Diagn. 2005; 7(3): 317–326.

10. Miotona mišićna distrofija • Miotona distrofija tip 1 - mutacije na DMPK(distrofija miotonika-protein kinaza) genu, dok tip 2 - mutacije na CNBPgenu. Protein koji kodira DMPKgen igra ulogu u komunikaciji ćelija. Protein koji kodira CNBP gen (srce i skeletna muskulatura) pomaže regulaciju funkcija drugih gena. • MD nastaje zbog abnormalnog ponavljanja segmenta DNA, nastaje nestabilna regija gena, mutirani gen stvara velike količine mRNA -abnormalno duga mRNA formira ugruške koji interferiraju sa drugim proteinima. 3’ regija na 19q13

11. Miotona mišićna distrofija • CNBP – (ZnF9) ponavljanje CCTG tetranukleotid sekvence u prvom intronu 3q21. Fiziološki manje od 26 puta, oboljeli imaju 75 – 11000 puta ponovke. • Miotona distrofija tip 1 (DM1) • za detekciju ekspanzije trinukleotidni ponovaka do 125 CTG ponovaka - PCR (fluorescentno obilježeni prajmeri; kapilarna elektroforeza) • dugački ponovci se analiziraju Triplet-repeat Primed PCR ili Southern blotting za određivanje veličine ponovaka • Kvantitativni RT-PCR da određivanje nivoa mRNA DMPK gena u mišićnoj biopsiji • Miotona distrofija tip 2 (DM2) • Dugački ponovci Quadruplet-repeat Primed PCR ili Southern blotting genomske DNAza određivanje veličine ponovaka

12. Facioskapulohumeralna mišićna distrofija • U oko 95% slučajeva FSHD je uzrokovana heterozigotnom parcijalnom delecijom kritičkog broja repetitivnih elemenata (D4Z4) na hromozomu 4q35 (FSHD1). U oko 5% bolesnika sa FSHD, nije utvrđenaredukcija D4Z4 ponavljanja - FSHD2. Oni pokazuju gubitak DNA metilacije i heterohromatinske markere, slično kao kod FSHD1. www.jcb.org/cgi/doi/10.1083/jcb.201007028

13. Facioskapulohumeralna mišićna distrofija • Parcijalna delecija D4Z4 ima za posljedicu promjenu hromatina i gubitak odgovarajuće kontrole genske ekspresije. • Molekularni rearanžman uzrokuje varijaciju broja kopija ponovaka mikrosatelita nazvanog D4Z4, veličine 3.3 kbp, koji je izuzetno polimorfičan i varira od 11-150 kopija. Broj preostalih ponovaka je povezan sa životnom dobi pojave simptoma, težinom bolesti i progresijom – veće delecije - teža slika FSHD • Southern blot analiza za utvrđivanje broja ponovaka • Prenatalno i preimplantacijsko testiranje

14. Udno-pojasna mišićna distrofijaLimb-gridle muscular dystrophy (LGMD) Molekularna dijagostika je kompleksna jer je genotipski i fenotipski heterogena. Identifikovano je 23 LGMD gena; 15 je u vezi sa autosomno recesivnim naslijeđivanjem. Limb-girdle MD, tip 2D (LGMD2D)Molekularno testiranje α-sarcoglycan (SGCA)PCR detekcija tačkaste mutacije (c.229C>T) Limb-girdle MD, tip 2E (LGMD2E) Molekularno testiranje β-sarcoglycan (SGCB) PCR detekcija tačkaste mutacije (c.341C>T) Limb-girdle MD, tip 2I (LGMD2I) Molekularno testiranje fukutin-related protein (FKRP) PCR detekcija tačkaste mutacije (c.826C>A) Ostale se mogu dijagnosticirati direktno sekvenciranjem, najčešća je Limb-girdle MD, tip 2A (LGMD2A) Molekularno testiranje calpain-3 (CAPN3) • Analiza genomske DNA: PCR-ARMS, RFLP-PCR, Southern blot • Biopsija mišića: RNA i Western blot.