1.-Unidad Oncología Médica del Hospital Universitario de Albacete

1. * *α= 2.31 * p=0.043 RR= 1.1 PAP= 5% M B +/+ +/- -/- +/+ +/- +/- +/+ +/+ +/+ +/- +/- -/- +/+ 1500 1000 700 500 300 200 100 GSTT1 y GSTM1, POSIBLES FACTORES ASOCIADOS AL DESARROLLO DE CÁNCER DE COLON José Luis Sánchez Sánchez¹,2, Marisa Maestro³, Marta Vidaurreta³, Francisco Sánchez Sánchez4, José María García Bueno¹, Antonio Fernández Aramburo1 y Carmen Ramírez-Castillejo² 1.-Unidad Oncología Médica del Hospital Universitario de Albacete 2.- Laboratorio de Biología Celular y Molecular de Célula Madre. Centro Regional de Investigaciones Biomédicas/Facultad de Medicina de UCLM. 3.- Unidad de diagnóstico genético del cáncer, Hospital Clínico San Carlos, Madrid 4.- Área de Genética. Facultad de Medicina de UCLM INTRODUCCIÓN: La farmacogenómica se define como el estudio de factores inherentes (variaciones de ADN) y su influencia en la variación interindividual en la respuesta a los tratamientos, marcadas de esta forma en nuestro genoma. Con los recientes avances en numerosas técnicas de análisis del ADN, polimorfismos genéticos (como los polimorfismos de un único nucleótido o SNPs) pueden ser detectados y evaluados de forma sencilla y rápida para determinar si presentan asociación o no con el desarrollo de diferentes tumores. Las aminas aromáticas son carcinógenos inductores de tumores. Las glutathione S-transferasas (GSTs), están implicadas en la canalización de la reducción de estos compuestos. Entre los diferentes genes pertenecientes a esta familia de proteínas con función antioxidante, los genes GSTM1 y GSTT1 han mostrado un especial interés en los últimos años en estudios epidemiológicos. Estudios moleculares han mostrado variaciones interindividuales respecto a la capacidad de metabolizar compuestos tóxicos y carcinogénicos, y estudios epidemiológicos han mostrado asociación entre determinados polimorfismos de estos genes y el incremento del riesgo de desarrollar diferentes enfermedades, como por ejemplo cáncer. OBJETIVO:En nuestro trabajo queremos estudiar la posible asociación de determinados alelos de polimorfismos de los genes GST M1 y T1, en la aparición del evento neoplásico, la progresión del paciente de cáncer de colon, su respuesta al tratamiento así como su susceptibilidad a la recidiva tumoral. MATERIAL Y MÉTODOS: 1) Para este estudio se han utilizado una serie de 100 pacientes con cáncer colorrectal, todos ellos intervenidos por el mismo cirujano, pertenecientes al banco de biomuestras del Hospital Clínico San Carlos (Madrid). Como control usamos una población de 100 individuos de similares características (edad, sexo, etc), obtenidas bajo consentimiento informado a partir de población general en la que se ha descartado la presencia de desarrollo tumoral. 2) Extracción de ADN: A partir de sangre venosa periférica se extrajo el ADN genómico mediante la utilización de un kit comercial de extracción de ADN: DNA Blood Kit (Omega). 3) El análisis de las variantes polimórficas del gen GSTT1, se ha llevado a cabo mediante PCR, y posterior análisis mediante electroforesis en gel de agarosa ya que el polimorfismo corresponde a una deleción completa del gen, de la cual se conoce la región deleccionada. 4) Se ha intentado la caracterización de la zona deleccionada, que debido a su alta similitud con zonas comunes a las zonas flanqueantes, no ha podido ser caracterizada, para ello se han utilizado parejas de cebadores consecutivas hasta acotar toda la deleción 5) El gen GSTM1 ha sido analizado mediante la técnica de PCR cuantitativa con sonda taqman que detecta el alelo wt y no el alelo mutante. 6) Realización de una base de datos con los datos clínicos de evolución y respuesta de los pacientes del estudio y los datos moleculares de GST T1 y GST M1. 7) Los resultados han sido analizados con el paquete estadístico SPSS, mediante el análisis de χ2 dePearson, con el análisis del riesgo relativo y la proporción atribuíble poblacional para las variables independientes enfermedad o libre de enfermedadad y el estadístico α (Odds ratio) del análisis estratificado de Mantel – Haenszel para el estudio de la variable categórica recaída en los pacientes diagnosticados de cáncer de cólon. Figura 4:Leyenda de colores en la secuencia del gen GSTT1: Amplicón 1500 pb; Amplicón 600 pb; Amplicón 250 pb; Amplicón 580 pb,Base alterada. Sitio postulado de la delección GST T1 GST M1 RESULTADOS Figura 1: A, Ejemplo de amplificación mediante PCR-Q del gen GST M1. Figura 5: secuenciación GSTT1 zonas homólogas. Figura 6: Bajo estas líneas el esquema de las similitudes entre las distintas secuencias, lo que dificulta el diseño de cebadores para localizar el alelo mutante. Figura 2: Cuantificación de los resultados de la PCR-Q para GSTM1. Observar que la presencia de la mutación en estado homocigoto -/- es más abundante en los pacientes que han desarrollado la enfermedad *(p>0.05). Por lo que se ha encontrado que la presencia del alelo delecionado en homocigosis es un Factor de Riesgo para padecer cáncer de colon, aunque solo con un riesgo relativo (RR) de 1.1, lo que supone, debido a la prevalencia del factor entre la población enferma, una proporción atribuible poblacional PAP de un 5%. Figura 3: Análisis de los resultados de PCR-Q dentro del grupo de pacientes con cáncer de colon, en función de las recaídas de los pacientes. α (Odds ratio) indica en qué medida la ratio recaída / no recaída es menor en el grupo de referencia con presencia de la deleción en homocigosis que en el grupo focal con al menos un alelo wt. El estadístico de Mantel – Haenszel nos da un α= 2.31, lo que indica que hay diferencias significativas a favor del grupo con la deleción en homocigosis. Es decir, que los pacientes con la delección en homocigosis GSTM1-/- recaen en menor proporción que los que tienen un alelo wt. Figura 7: Amplificación por PCR convencional de los alelos wt (450pb) y delecionado (1500pb) del gen GSTT1. del wt • Conclusiones: • En el caso del gen GST M1, la técnica de PCR cuantitativa con sondas Taqman es una técnica rápida y eficaz para la localización de los pacientes con la deleción en homocigosis. • La presencia del alelo delecionado en homocigosis GSTM1-/- es un Factor de Riesgo para padecer cáncer de colon, con un RR de 1.2 con una medida de impacto de proporción atribuible población (PAP) de 5%. • Los pacientes con deleción GSTM1 en homocigosis recaen en menor proporción, después del tratamiento, que los que presentan un alelo wt. • - La caracterización de la deleción GSTT1 ha sido por el momento ineficaz, debido a la alta similitud de la zona donde se localiza la deleción con las zonas flanqueantes. • - Se han diseñado nuevos cebadores tras la secuenciación de los alelos mutantes de algunos pacientes. Estos cebadores están diseñados terminando en la única base alterada en la secuencia y los primeros resultados están proporcionando diferencias entre pacientes y controles. Bibliografía * Sprenger R. Schalagenhaufer R, Kerb R, Bruhn C, Brockmöller J, Roots I and Brinkmann U. Characterization of the glutation S-trasferase GSTT1 deletion: discrimination of all genotypes by polymerase chain reaction indicates a trimodular genotype-phenotype correlation. Pharmacogenetics 2000, 10:557-565 * Fernandez-Peralta AM, Daimiel L, Nejda N, Iglesias D, Medina Arana V, González-Aguilera JJ. Association of polymorfphisms MTHFR C677T and A1298C with risk of colorectal cancer, genetic and epigenetic characteristic of tumors, and response to chemotherapy. Int. J. Colorectal Dis. DOI 10.1007/s00384-009-0779-7