Cryptosporidia i Giardia Analityka i wyzwania Dr Katrin Luden

1. Dr. K. Luden Cryptosporidia i Giardia Analityka i wyzwania Dr Katrin Luden Warsaw March 2009 1

2. Dr. K. Luden C. parvumpasożyty wewnątrzkomórkowe wywołujące biegunkę Zakażenie wywoływane przez oocysty (5 µm) zawierające sporozoity (dawka wywołująca zakażenie 1-10 oocysts) Przenoszone drogą fekalną lub przez zanieczyszczoną wodę Rezerwuar: kręgowce, np. bydło, konie, kozy, owce, psy, koty, ptaki… Czas inkubacji 7-10 (1-12) dni Możliwe wydalanie z odchodami przez okres kilku tygodni Do tej pory brak specyficznej terapii Środki profilaktyczne: podgrzewanie do 60°C przez 30 min. lub gotowanie Cryptosporidium Warsaw March 2009 2

3. Dr. K. Luden G. lamblia pasożyt jelita cienkiego wywołujący biegunkę Zakażenie wywołują cysty (7x 12 µm) zawierającetrofozoity Przenoszone drogą fekalną lub przez zanieczyszczoną wodę Rezerwuar: ludzie, kręgowce? Czas inkubacji 3 - 25 (1-14) dni Istnieje terapia lekowa Może trwać w stadium bezobjawowym przez lata Giardia Warsaw March 2009 3

4. Dr. K. Luden Załącznik I Część C: Parametry wskaźnikowe Clostridium perfringens Uwaga 2: Tego parametru nie trzeba mierzyć, chyba że woda pochodzi z wód powierzchniowych lub znajduje się pod ich wpływem. W przypadku niezgodności z wartością parametryczną, dane Państwo Członkowskie musi zbadać dostawę w celu zapewnienia, że nie ma potencjalnego zagrożenia dla zdrowia ludzkiego wynikającego z obecności mikroorganizmów chorobotwórczych np.: cryptosporidium. Państwa Członkowskie muszą włączyć wyniki tych badań do sprawozdań, które przedkładają na mocy art. 13 ust. 2. Dyrektywa w sprawie wody do spożycia 98/83/EC Warsaw March 2009 4

5. Dr. K. Luden Załącznik I Część C: Parametry wskaźnikowe Clostridium perfringens Tego parametru nie trzeba mierzyć, chyba że woda pochodzi z wód powierzchniowych lub znajduje się pod ich wpływem. W przypadku niezgodności z wartością graniczną, dane Państwo Członkowskie musi zbadać system zaopatrzenia w celu zapewnienia, że nie ma potencjalnego zagrożenia dla zdrowia ludzkiego wynikającego z obecności mikroorganizmów chorobotwórczych np.: cryptosporidium. Właściwe władze informują Federalne Ministerstwo Zdrowia przez najwyższe władze kraju związkowego. Niemiecka ustawa o wodzie do spożycia Warsaw March 2009 5

6. Dr. K. Luden Metody stosowane rutynowo w USA i ZK: US EPA 16223 oraz ZK (DWI), podobne do ISO 15553 Wartości graniczne i metody Warsaw March 2009 6

7. Dr. K. Luden Jakość wody – wyodrębnianie z wody i identyfikacja oocyst Cryptosporidiumoraz cyst Giardia Zakres: brak identyfikacji gatunku, brak oznaczania żywotności, brak oznaczania zjadliwości Zasada: Stężaniez wody przez filtrację i elucję, po której następuje powolne wirowanie Oczyszczanie metodą separacji immunomagnetycznej (immunomagnetic separation - IMS) Wykrywanie metodą epifluorescencji oraz mikroskopii w systemie kontrastu interferencyjno – różniczkowego (differential interference contrast - DIC) ISO 15553 Warsaw March 2009 7

8. Dr. K. Luden Próbobranie: 10 do 1.000 lwody – do pojemników transportowych lub filtrowanie na miejscu przepływ oraz ciśnienie mogą być ograniczone przez dobór filtra Około 95-100 % pasożytów zatrzymywane jest na filtrze Stopień odzysku całej metody podlega znaczącym wahaniom (10-80 %), w zależności od matrycy Mętność jest istotna (przyleganie oocyst/cyst do cząsteczek?) ISO 15553 Warsaw March 2009 8

9. Dr. K. Luden Stężanie Pompy perystaltyczne zwykłe Przepływomierz(określenie ilości oocyst / objętość) Kapsuła filtra Envirocheck, Filta Max Miejsce pobrania (woda surowa, uzdatniona, kranowa) Odpływ Warsaw March 2009 9

10. Dr. K. Luden Kapsuła filtra jest płukana, a bufor elucyjny zbierany w probówkach do wirowania Wirowanie Zlanie supernatantu Oczyszczanie / IMS Stężanie Warsaw March 2009 10

11. Dr. K. Luden Kapsuła filtra jest płukana, a bufor elucyjny zbierany w probówkach do wirowania Wirowanie Zlanie supernatantu Oczyszczanie / IMS Stężanie Warsaw March 2009 11

12. Dr. K. Luden Separacja immunomagnetyczna Oczyszczanie metodą IMS Element paramagnetyczny Przeciwciała cryptosporidium Oocysta Y Y Kompleks oddzielany od cząstek stałych przy pomocy magnesów i przemywania Warsaw March 2009 12

13. Dr. K. Luden IMS Warsaw March 2009 13

14. Dr. K. Luden Separacja immunomagnetyczna Y Oczyszczanie metodą IMS / Wykrywanie Barwienie przeciwciałami połączonymi z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) Rozbicie kompleksu przez zastosowanie kwasu (wysokiej temperatury) Y Wykrywanie przy pomocy mikroskopu Warsaw March 2009 14

15. Dr. K. Luden Wykrywanie Mikroskopia epifluorescencyjna i DIC (Differential interference contrast – kontrast interferencyjno - różniczkowy) Zalecane jest barwienie DAPI w celu wykrycia jąder sporozoitów trofozoitów Przy pomocy DIC można wykryć wewnętrzne cechy morfologiczne Cryptosporidium oocysta 4-6 µm Giardiacysta 8-12 µm x 7-10 µm Warsaw March 2009 15

16. Dr. K. Luden Wyzwania Warsaw March 2009 16

17. Dr. K. Luden Charakterystyka wyników • Odzysk, granica wykrywalności, efekt matrycy • Metoda niezbyt dobrze odróżnia komórki żywe od martwych i zakaźne od niezakaźnych • Zawsze konieczna analiza kilku próbek: • próba porażona (kontrola pozytywna, oznaczenie odzysku) • próba naturalna • wiarygodna kontrola negatywna (wykluczenie zanieczyszczenia krzyżowego sprzętu, ocena fluorescencji tła…) Koszt ~ 400 €(kapsuła filtra, barwienie, sprzęt, czas) Warsaw March 2009 17

18. Dr. K. Luden Sytuacja w Niemczech Kontrole jakości: badanie biegłości? W Niemczech niewiele laboratoriów stosuje tę metodę (np. Federalna Agencja Środowiska) Brak badań biegłości (jak przesyłać próby wody o pojemności 10 l?) Większość wody do spożycia pochodzi ze starych wód podziemnych: źródło bardzo bezpieczne Nie ma konieczności przeprowadzania tej analizy, ale również bark możliwości szybkiego wdrożenia metody na poziomie laboratorium Warsaw March 2009 18

19. Dr. K. Luden Kryptosporydioza w Dolnej Saksonii Liczba zgłoszonych przypadków Warsaw March 2009 19

20. Dr. K. Luden Kryptosporydioza w Dolnej Saksonii Dolna Saksonia – 7,9 miliona mieszkańców 1 zgłoszony incydent na 50000 mieszkańców na rok 90% wody do spożycia z chronionych wód podziemnych („stara” woda podziemna) Wody powierzchniowe mają wpływ na 10% wody do spożycia Warsaw March 2009 20

21. Dr. K. Luden Zagadnienia dla służb ochrony zdrowia • W przypadku kryptosporydiozy • rodzaj dostaw wody (publiczne, prywatna studnia, wody podziemne, woda uzdatniona…) • rodzaj obszaru (wiejski, gospodarstwo rolne…) / kontakt z obornikiem... • kontakt z osobą cierpiącą na biegunkę • wizyta w gospodarstwie hodowlanym • kontakt z cielętami, zwierzętami domowymi, mlekiem niepasteryzowanym • plac zabaw • pływalnia publiczna Warsaw March 2009 21

22. Dr. K. Luden Potencjalne zanieczyszenie pochodzenia fekalnego • Wystąpienie pasożytów możliwe, ale brak możliwości przeprowadzenia analizy laboratoryjnej • Ważne informacje o rodzaju dostaw wody jako podstawa oceny ryzyka • Technika pobierania prób / punkt pobrania • System dystrybucji (rury, etc.) • Typ dystrybuowanej wody / ujęcia • Uzdatnianie (firma wodociągowa, poszczególne etapy) • Zlewnia Plan bezpieczeństwa wodnego / system wielobarierowy Warsaw March 2009 22

23. Dr. K. Luden Dziękuję Państwu za uwagę! Warsaw March 2009 23