Corso Nazionale AMCLI MYCO-09 CORSO di MICOBATTERIOLOGIA AVANZATA LA SICUREZZA NEL LABORATORIO di MICOBATTERIOLOGIA Do

1. Corso Nazionale AMCLI MYCO-09 CORSO di MICOBATTERIOLOGIA AVANZATA LA SICUREZZA NEL LABORATORIO di MICOBATTERIOLOGIA Dott. Antonella Lo Nostro Firenze 19 gennaio 2009

2. LE INFEZIONI in LABORATORIOdi MICOBATTERIOLOGIA Talerischio deriva dalla manipolazione di materiali biologici potenzialmente infetti e dalla manipolazioneecoltivazione (amplificazione) di MICOBATTERIper l’identificazione, tipizzazione ed esecuzione di saggi di sensibilità ai chemioantibiotici. Il LABORATORIO DI MICOBATTERIOLOGIA costituisce un ambiente di lavoro dove, per la pericolosità dei materiali processati e per la complessità delle attività che vi si svolgono, deve essere posta una particolare attenzione alla TUTELA DELLA SALUTE e dellaSICUREZZAdegli operatori sanitari. TUTTO IL PERSONALE PUÒ ESSERE ESPOSTO A RISCHIO DI CONTAGIO

3. LABORATORIO MICOBATTERIOLOGIA Materiali biologici MICOBATTERI PERICOLO RISCHIO RESIDUO ACCETTABILE per l’operatore SICUREZZA Misure di Prevenzione Misure di Protezione Protezione dell’ambiente e della comunità RISCHIO

4. Principi Rischio biologico nel Laboratorio di Micobatteriologia • PROTEZIONE: • operatore • “prodotto” • altri operatori nella stanza • personale di supporto del laboratorio • ambiente

5. RISCHIO BIOLOGICO PROPRIETÀ INFETTANTI dei MATERIALI : Patogenicità intrinseca degli agenti biologici Funzione dell’energia necessaria per l’esecuzione di una procedura: Bassa energia (distribuzione terreni liquidi, rimozione tappi a vite): goccioline sull’operatore e superfici Alta energia (omogenizzazione, centrifugazione): aerosols inalabili TIPOLOGIA di ATTIVITÀ: agenti biologici DELIBERATEMENTE manipolati e amplificati in vitro (terreni di coltura, etc.) materiali biologici per indagini diagnostiche, POTENZIALMENTE contaminati

6. RISCHIO BIOLOGICO CONDIZIONI PREDISPONENTI la TRASMISSIONE: ospite sensibile (immunocompromissione, gravidanza, patologie croniche) opportune vie di penetrazione (inalazione, contatto, inoculazione, ingestione) patogenicità dell’agente biologico sufficiente concentrazione del patogeno: dose minima infettante: Mycobacterium tuberculosis: < 10 cfu in 2-3 dropplets

7. Trasmissione della tubercolosi • Dose infettante: 1-10 bacilli, 1-3 droplet nuclei

8. LE INFEZIONI in LABORATORIO MODALITA’ di TRASMISSIONE Inalazione aerosol contaminati Inoculazione parenterale Contaminazione cutanea e/o mucosa Ingestione

9. VIE DI PENETRAZIONE E RELATIVE ATTIVITÀ LAVORATIVE CHE POSSONO ESPORRE A RISCHIO DI INFEZIONE(1) Inalazione: (aerosol) Sfregamento dell’ansa su un terreno di coltura, soprattutto se la superficie è ruvida. Striscio del materiale sulla superficie di un vetrino. Raffreddamento dell’ansa di metallo nel terreno di coltura. Flambaggio dell’ansa di metallo. Utilizzo improprio delle pipette. Agitazione di sospensioni batteriche. Scarico della pipetta su una superficie rigida. Centrifugazione di materiale infetto, soprattutto quando si verifica un danno ai contenitori durante la centrifugazione. Utilizzo di miscelatori, omogeneizzatori, sonicatori, agitatori e vortex su campioni clinici o colture. Versamento o travaso di brodocolture e rovesciamento del materiale infetto. Apertura di tappi o coperchi dei contenitori dei terreni di coltura. Liofilizzazione e filtrazione sotto vuoto. Gli aerosol contaminano persone, superfici, strumenti e canali di aerazione.

10. VIE DI PENETRAZIONE E RELATIVE ATTIVITÀ LAVORATIVE CHE POSSONO ESPORRE A RISCHIO DI INFEZIONE (2) Ingestione: Pipettaggio a bocca. Schizzi di materiale infetto in bocca. Introduzione di materiale contaminato o dita in bocca. Ingestione di cibo o bevande, applicazione di rossetto, fumo nelle aree di lavoro. Inoculazione: Manipolazione di aghi e siringhe. Manipolazione di vetri rotti, bisturi e altri oggetti appuntiti o taglienti. Imbrattamento: (contaminazione cute e mucose) Schizzi di materiale infetto negli occhi, bocca, naso e sulla pelle. Esposizione della cute non integra a materiale contaminato. Lavoro su superfici contaminate. Manipolazione di equipaggiamenti contaminati. Manipolazione non corretta di anse, aghi da inoculo o tamponi contenenti campioni o materiale da coltura.

11. La FORMAZIONE di AEROSOL, è il più importante fattore di rischio di infezione da Mycobacterium tuberculosis per il personale di laboratorio. La diffusione di MTb nell’ambiente attraverso il bioaerosol contaminato é un pericolo spesso sottovalutato, in quanto l’aerosol può essere trasportato delle correnti di aria anche a distanza dal luogo di origine. Tecniche di cultura rapida in terreno liquido (BACTEC), sembrano incrementare il rischio di infezioni tubercolari associate a punture da ago. Di recente anche il sangue è stato individuato come possibile fonte di contagio in seguito all’aumento dei casi di batteriemia, frequente nei soggetti immunodepressi (HIV/AIDS). Il contatto diretto con la cute o mucose, l’ingestioneo l’ inoculo parenterale rappresentano i principali rischi di laboratorio associati alla manipolazione di materiali o colture contenenti micobatteri non tubercolari MOTT (Mycobacterium kansasii, Mycobacterium avium complex, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium marinum,Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium chelonae, ecc.)

12. Mycobacterium tuberculosis per l’uomo DI50= 10 bacilli • L’incidenza dell’infezione tubercolare, fra il personale di laboratorio, è stimata essere da tre a nove volte maggiore di quella fra individui che svolgono altre attività lavorative in ambito sanitario. • E’ stata riportata un’incidenza annuale di tubercolosi, fra il personale di laboratorio in Utah, di 0.3 infezioni su 1000 persone • In Gran Bretagna l’incidenza varia da 0.035 a 0.56 infezioni su 1000 persone. • Uno studio su 77 laboratori di micobatteriologia, ha evidenziato un’incidenza di 26.3 infezioni per 1000 addetti, pari a 100 volte la frequenza nella popolazione generale.

13. Rischio di infezione • Il rischio di infezione tubercolare per chi opera in un laboratorio di micobatteriologia è proporzionale al numero di campioni positivi processati ed alla loro carica bacillare • 3-5 volte superiore a quello di chi opera in altri laboratori • 100 volte superiore a quello della popolazione normale

14. IL RISCHIO di INFEZIONE nei • LABORATORI di MICOBATTERIOLOGIA • DIPENDE • quanto frequentemente vengono riscontrati esami positivi per MT • dalla concentrazione di MT nei campioni • dal numero di campioni maneggiato da ciascun operatore • dagli standard di sicurezza adottati nel laboratorio. • Ogni campione sospetto positivo per MT deve essere considerato potenzialmente infettante (norma di protezione universale).

15. DLGS 626/94 –DLGS 81/08 Caratteristiche di pericolosità degli agenti biologici La pericolosità è valutata sia nei confronti della salute dei lavoratori che della popolazionein generale Caratteristiche di pericolosità sono: Infettività: capacità di un microrganismo di resistere alle difese dell’ospite e di replicarsi in esso Patogenicità: capacità di produrre malattia a seguito di infezione Trasmissibilità: capacità di un microrganismo di essere trasmesso da un soggetto portatore o malato ad un soggetto non infetto Neutralizzabilità: disponibilità di efficaci misure profilattiche per prevenire la malattia o terapeutiche per la cura

16. Classificazione degli agenti biologici in funzione della loro pericolosità Gruppo 1- scarsamente patogeni Gruppo 2- possono causare malattia rischio limitato di diffusione in comunità di norma disponibili misure profilattiche e terapeutiche (es. B. pertussis, C. albicans, Cl. tetani, L. pneumophila, S. aureus, V. cholerae) Gruppo 3- altamente patogeni serio rischio per i lavoratori possono propagarsi nella comunità di norma disponibili misure profilattiche e terapeutiche(es. Brucelle, M. tuberculosis, HBV, HCV, HIV) Gruppo 4 - altamente patogeni ed infettanti serio rischio per i lavoratori elevato rischio di propagazione in comunità;di norma non disponibili misure profilattiche e terapeutiche(es. Virus Ebola, Virus Lassa, Virus della febbre emorragica di Crimea/Congo)

17. DLGS 626/94 –DLGS 81/08 Misure di contenimento Sono indicati tre livelli di contenimento da adottarsi in funzione del gruppo di classificazione dell’agente biologico “materia prima del ciclo produttivo” applicabili ai Laboratori, Stabulari, Servizi Sanitari e Veterinari. Le misure di contenimento riguardano principalmente: • la separazione degli ambienti a rischio specifico • la limitazione dell’accesso a tali aree • il trattamento dell’aria immessa ed estratta • le caratteristiche delle superfici dei locali e degli arredi • le procedure di controllo dei vettori e le tecniche di disinfezione • le procedure per la manipolazione dei materiali infetti • le procedure di trattamento dei rifiuti e delle acque reflue

18. MISURE di CONTENIMENTO

19. CLASSIFICAZIONE LABORATORI MICOBATTERIOLOGIA • I laboratori di Micobatteriologia sono classificati secondo Linee Guida nazionali per il controllo della TB (1999) in 3 livelli di complessità: • I livello: (laboratorio di base) preparazione ed esecuzione di esame microscopico … • II livello: (laboratorio regionale) oltre alle procedure del I livello, esame colturale, identificazione MT e antibiogramma. • III livello: (laboratorio di riferimento) esame microscopico e colturale, antibiogramma, tipizzazione MT e MOTT, uso di alta tecnologia, coordinamento con gli altri laboratori per controllo di qualità, conservazione dei ceppi,…. • Secondo le Linee Guida nazionali/OMS : • Laboratori di I livello: si raccomandano misure di contenimento a livello 2(BL2) • Laboratorio di II e di III livello: si raccomandano misure di contenimentoa livello 3(BL 3)

20. DRASTICA RIDUZIONE della produzione di AEROSOL diffusi nell’ambiente con l’uso di apparecchiature conformi alle normative vigenti (centrifughe di sicurezza, cappe biohazard, pipettatori automatici, ecc.) progettate in funzione della sicurezza. MISURE DI PROTEZIONE • DUE LIVELLI DI PROTEZIONE attraverso: • 1- BARRIERE PRIMARIE insieme dimisure atte a prevenire la contaminazione dell’operatore professionalmente esposto • norme tecniche (uso di tecniche e di attrezzature da laboratorio in grado di ridurre la produzione di aerosol; uso corretto delle cappe "bio-hazard; utilizzo sistematico idonei DPI: tute guanti, occhiali o visiera, maschere, ecc.) • norme igieniche (adozione, durante l’attività lavorativa, di comportamenti "sicuri" quali non bere, non mangiare, non fumare, non applicare cosmetici, lavare le mani correttamente, non indossare il camice al di fuori del laboratorio, non contaminare superfici e oggetti utilizzati da altri, ecc.)

21. Le CAPPE SICUREZZA BIOLOGICA (CBS) impiegate nel modo corretto, agiscono come barriere, eliminando o riducendo il rischio di infezione impedendo la diffusione degli aerosol e degli schizzi verso l’operatore e l’ambiente esterno; possono anche garantire la sicurezza del campione prevenendo contaminazioni esterne e crociate.

22. Cabina di biosicurezza classe IIB • Dislocata in posizione a bassa probabilità di disturbo del flusso • Contenuto limitato agli oggetti indispensabili • Contenitori di scarto con disinfettante, sigillabili

23. I filtri HEPA • High Efficiency Particulate Air: groviglio di fibre ad orientamento casuale • Rimozione di almeno il 99,97% delle particelle in sospensione nell’aria con diametro di 0,3 μm • Modalità di azione: • intercettamento (particelle con diametro >0,4 μm) • impatto • diffusione (particelle con diametro <0,1 μm)

24. Disinfezione con alcol di tutti i materiali che escono dalla CBS

25. Sterilizzazione dell’aria The Virobuster Steritube is an innovative system for sterilizing air. Micro biological contamination is eliminated up to 100% with a one pass-through. Thus effectively protecting against the spread of moulds, bacteria and viruses like Aspergillus, Anthrax, TBC, MRSA, Legionella, Influenza (SARS,H5N1), EV71, Noro, etc

26. 2-BARRIERE SECONDARIE: • Le barriere primarie da sole non sono sufficienti a prevenire, in caso di incidenti, la diffusione nell’ambiente esterno di Micobatteri con conseguente rischio per la collettività. • In caso di manipolazione di agenti patogeni del III gruppo si deve operare all’interno di barriere secondarie, ossia all’interno di ambienti concepiti per garantire il contenimento biologico. • L’adozione di barriere secondarie implica L’ADEGUAMENTO STRUTTURALE DEI LABORATORI ALLA NORME DI SICUREZZA.

27. REQUISITI INDISPENSABILI BL3 ASPETTI STRUTTURALI • Area di lavoro esclusivamente dedicata • Accesso controllato all’area di lavoro dedicata • Area di lavoro separata da qualsiasi altra attività nello stesso edificio • Area di lavoro in grado di contenere tutte le attrezzature e la strumentazione necessaria • Pressione negativa nell’area dedicata • Possibilità chiusura ermetica della stanza per disinfezione • Ventilazione adeguata con filtrazione dell’area estratta mediante ultrafiltro HEPA (12 ricambi aria/hsenza ricircolo rimuovono circa il 99% del particolato in 23’ - 6 ricambi aria/h senza ricircolo rimuovono circa il 99% del particolato in 46’)

28. Pressione negativa: -15 Pascal Lavandino e lava-occhi Registro visite autorizzate Scorte di camici monouso, soprascarpe, ecc. Quadrante per il controllo della pressione all’interno del laboratorio Indicazione delle regole di ingresso e delle responsabilità Zona “FILTRO” del laboratorio di III livello

29. Il laboratorio di III livello • Pressione negativa: - 30 Pascal • Ricambi d’aria: 10-12/ora (rimozione del 99% delle particelle in 20 min) attraverso filtri HEPA sia in entrata che in uscita • Autoclave passante • Cabina di biosicurezza di classe II (controllo periodico dell’efficienza) • Locali facilmente decontaminabili in caso di incidente

30. Disinfezione del laboratorio • Giornaliera (notturna) con radiazioni UV • Periodica con idrossido di idrogeno vaporizzato • Ossidazione della componente lipidica delle membrane • Alterazione di ribosomi e DNA • Residui costituiti da H2O ed O2

31. DLGS 626/94 – DLGS 81/08 • IN CASO DI “EMERGENZA” • Se si verificano incidenti che possono provocare la dispersione nell’ambiente di un agente biologico appartenente ai gruppi 2, 3 o 4, i lavoratori devono abbandonare immediatamente la zona interessata, cui possono accedere soltanto quelli addetti ai necessari interventi, con l’obbligo di usare gli idonei mezzi di protezione. • Il Piano di emergenza per i laboratori BL 2 e BL 3: deve prevedere specifiche istruzioni per l’evacuazione e le procedure di decontaminazione. • In caso di incidente con spandimento di materiale infettante il personale deve abbandonare il laboratorio: dopo almeno 2 ore di ricambio d’aria, personale attrezzato con MASCHERE FACCIALI FILTRANTI (FPP3 LS con filtri al carbone attivo) deve entrare nel locale e trattare il luogo dell’incidente con micobattericidi (Ipoclorito di Na 5%, formaldeide). • Nel caso di grave contaminazione il locale deve essere trattato con vapori di formaldeide.

32. In caso di incidente . . . • Indossare la maschera FFP3 • Coprire il luogo con tessuto impregnato di varichina o polifenoli • Uscire dal laboratorio dopo aver tolto camice, soprascarpe, guanti • Esporre un cartello di pericolo all’ingresso • Non rientrare in laboratorio prima che siano trascorsi 30 minuti La registrazione degli incidenti permette l’identificazione delle situazioni più rischiose che dovrebbero essere oggetto di discussione in incontri periodici di tutto il personale

33. DISPOSITIVIDIPROTEZIONEINDIVIDUALE MASCHERE GUANTI OCCHIALI CAMICE SOPRASCARPE

34. PROTEZIONE RESPIRATORIA PER MYCOBACTERIUM TUBERCULOSISCDC 1994 i dispositivi N95/FFP2 sono considerati sufficienti e raccomandati per la prevenzione del contagio I dispositivi di classe FFP3 SL devono essere utilizzati dal personale che esegue procedure di decontaminazione

35. Usare la misura adatta Attenzione alla barba COME INDOSSARE LA MASCHERA Usare la misura adatta L’efficacia delle maschere si riduce quando non aderiscano correttamente al volto Attenzione alla barba

36. PREVENZIONE E CONTROLLO DEL RISCHIO BIOLOGICO SORVEGLIANZA SANITARIA 1 - “I lavoratori addetti alle attività per le quali la valutazione dei rischi ha evidenziato un rischio per la salute sono sottoposti alla sorveglianza sanitaria (intradermoreazione di Mantoux: 1 anno – 6 mesi in relazione al grado di esposizione) 2 - Il datore di lavoro, su conforme parere del medico competente, adotta misure protettive particolari per quei lavoratori per i quali, anche per motivi sanitari individuali, si richiedono misure speciali di protezione, fra le quali: a) la messa a disposizione di vaccini efficaci per quei lavoratori che non sono già immuni all’agente biologico presente nella lavorazione, da somministrare a cura del medico competente b) l’allontanamento temporaneo del lavoratore.....” Il medico competente fornisce ai lavoratori adeguate informazioni sul controllo sanitario cui sono sottoposti e sulla necessità di sottoporsi ad accertamenti sanitari anche dopo la cessazione dell’attività …….

37. DLGS 626/94 –DLGS 81/08 SORVEGLIANZA SANITARIA • corretta informazione del lavoratore a rischio • riconoscimento precoce di stati individuali e/o ambientali atti a favorire l’aggressione da parte di agenti biologici (MT) • presenza di eventuali patologie o alterazioni che potrebbero subire aggravamenti in caso di esposizione ad agenti biologici (MT) • impostazione di programmi di immunoprofilassi (DPR 465/2001 obbligo alla vaccinazione anti tubercolare La vaccinazione antitubercolare e' obbligatoria per: …… b) personale sanitario, e chiunque, a qualunque titolo, con test tubercolinico negativo, operi in ambienti sanitari ad alto rischio di esposizione a ceppi multifarmacoresistenti oppure che operi in ambienti ad alto rischio e non possa, in caso di cuticonversione, essere sottoposto a terapia preventiva, perche' presenta controindicazioni cliniche all'uso di farmaci specifici)

38. Come? La SICUREZZA nel LABORATORIO di MICOBATTERIOLOGIA • Adeguamento dellestrutture in funzione della destinazione d’uso degli ambienti. • Revisione ed adeguamento degliimpianti: • impianto antincendio (rilevazione ed abbattimento) • impianto elettrico, impianto di ventilazione e/o condizionamento • impianto di trasporto dei gas tecnici • Revisione delle procedure disicurezza (protocolli per disinfezione e sterilizzazione, procedure di emergenza) • Installazione diattrezzature disicurezza (cappe biohazard, ecc.) • Uso delle apparecchiaturedisicurezza (pipette, siringhe, ecc.) • UsoDPI(guanti, occhiali, maschere, grembiuli, ecc.) • CorrettaManutenzione (o garanzia d’uso) Precauzioni universali e GMP

39. COMPORTAMENTI NON CORRETTI (mancata attuazione della Buona Prassi di Laboratorio e delle Precauzioni Universali per errore umano, inesperienza, disinformazione, distrazione o eccessiva confidenza con il rischio biologico) POSSONO COMPROMETTERE l’AZIONE di MISURE di SICUREZZA e STRUMENTI di PROTEZIONE DLGS 626/94 –DLGS 81/08 INFORMAZIONE e FORMAZIONE Personale formato ed informato sul riconoscimento ed il controllo dei pericoli presenti nel laboratorio, è un elemento chiave nella prevenzione degli incidenti di laboratorio e delle infezioni contratte sul lavoro. A questo scopo è essenziale un addestramento ed una formazione continua sulle misure di sicurezza da attuare nei Laboratori di Micobatteriologia.

40. GRAZIE PER L’ATTENZIONE…