Physiopathologie du cœur embryonnaire soumis à l’anoxie-réoxygénation:

1. Physiopathologie du cœur embryonnaire soumis à l’anoxie-réoxygénation: Rôle protecteur du NO et des canaux KATP Alexandre Sarre Thèse de doctorat es Sciences de la Vie réalisée au Département de Physiologie Directeur de thèse: Dr Eric Raddatz

2. Introduction

3. Au cours du développement embryonnaire…

4. Le cœur est le premier organe à assumer sa fonction définitive: se contracter rythmiquement…

5. Afin d’apporter des nutriments et de l’oxygène à l’embryon.

6. L’embryon et le fœtus se développent dans un environnement naturellement pauvre en oxygène. • Cependant, toute diminution de la concentration en oxygène (hypoxie) perturbe le fonctionnement cardiaque et le développement de l’embryon. • C’est par exemple le cas lors d’un dysfonctionnement du placenta ou de torsion du cordon ombilical.

7. Cette adaptation peut avoir des répercutions à l’âge adulte (mémoire fœtale): • maladies cardiovasculaires (infarctus, hypertension) • syndromes métaboliques (diabète…)

8. De plus, la cardiologie et la chirurgie fœtale sont en plein essor. Il est donc important de comprendre les mécanismes cellulaires impliqués dans la pathologie du cœur immature.

9. Modèle expérimental

10. modèle expérimental in ovo embryon de poulet 96h; stade 24HH 4mm

11. dissection électrodes 1 cm cœur isolé spontanément contractile modèle expérimental in ovo in vitro cœur 4mm 1cm 1mm embryon de poulet 96h; stade 24HH ECG activité contractile productionROS/RNS

12. cœur battant spontanément membrane transparenteen silicone (échanges gazeux) GAZ (AIR, N2, CO2) MILIEU (HCO3-/CO2) ± agents pharmacologiques 37°C Chambre de culture Protocole expérimental normoxie (21% O2) anoxie (0% O2) réoxygénation (21% O2) 45 min 30 min 60 min

13. QRS T P 500 mV ECG CT V OG O contraction auriculaire 5 µm V EMDa V contraction ventriculaire 10 µm 1 mm EMDv 100 ms Mesure de l’activité électrique et mécanique mesure photométrique de la contraction OD électrodes ECG

14. excitation 490 nm AIR, N2 MILIEU émission 530 nm 37°C Mesuredela production radicalaire par la technique du DCFH cœur isolé CT O V 1mm + DCFH 10 µM

15. Profil temporel de production de ROS/RNS mesure continue de la fluorescence du DCFH échantillonage: toutes les 30s; déterminée sur une aire de 0.07 mm2 normoxie anoxie réoxygénation 21% O2 N2 21% O2 1.6 1.2 fluorescence (u.a.) 0.8 0.4 0 0 30 60 90 120 temps in vitro (min)

16. Résultats

17. Paramétres in vitro en normoxie PACEMAKER: rythme sinusal 165 ± 9 bpm DUREE DU POTENTIEL D’ACTION: durée du QT (cœur entier) 161 ± 14 ms oreillette isolée 78 ± 6 ms ventricule isolé (QT) 111 ± 7ms CONDUCTION AURICULO-VENTRICULAIRE: intervalle PR 130 ± 17 ms délai mécanique AV 150 ± 17 ms vitesse de propagation AV 15,7 ± 1 mm/s COUPLAGE EXCITATION-CONTRACTION: délaiélectro-mécanique auriculaire(EMDa) 21 ± 2 ms délaiélectro-mécaniqueventriculaire(EMDv) 14 ± 2 ms CONTRACTILITE: contraction ventriculaire (apex) 19 ± 7 µm vitesse de contraction(apex) 4,2 ± 1,4 mm/s METABOLISME: glycogène / protéine: - oreillette1,63 ± 0,72 (nmol GU / mg)- ventricule 0,90 ± 0,28 - conotroncus0,65 ± 0,25 moyenne ± DS; n=8-10

18. QRS T P Réoxygénation Anoxie 30 min Normoxie 100 ms Evolution de l’ECG au cours de l’anoxie-réoxygénation

19. * REOXYGENATION REOXYGENATION ANOXIE ANOXIE * 250 300 oreillette * 250 * 200 ventricule * * * * * * * * 200 * 150 * * 150 * 100 * * 100 260 * 50 50 220 180 160 * * 120 140 * * 80 * 100 * * * * * * 40 240 0 215 0.8 * 190 * * * 0.6 165 * 0.4 140 * * * * 0.2 L’activité cardiaque est rapidement altérée par l’A/R fréquence cardiaque (bpm) EMD(% préanoxique) intervalle PR(ms) contractionventriculaire(% préanoxique) durée du QT (ms) T / QRS 130 130 40 50 60 70 80 90 100 110 120 40 50 60 70 80 90 100 110 120 temps in vitro (min) temps in vitro (min) moyenne ± ESM; n=4; *:p<0,05 vs préanoxique

20. bloc AV 2/1 (anoxieetréox) bloc AV 3/1 (anoxieetréox) P P P P P P P P P P P P P P P QRS QRS QRS QRS QRS QRS 100 ms 400 ms Wenckebach (réox) échappement ventriculaire (réox) P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P QRS QRS QRS QRS 1s 1s L’anoxie et la réoxygénation entraînent de nombreuses arythmies

21. bloc AV (3ème degré) bloc AV (3ème degré) ECG 500 µV O 0.5 µm 1 µm V 10 s cardioplégie cardioplégie ECG 200 µV 0.5 µm O 5 µm V 5 s et des bouffées d’activité.

22. Les arythmies apparaissent selon un ordre particulier cardioplégie tachycardie sinusale bradycardie sinusale bradycardie sinusale arrêts sinoauriculaires intermittents (bursts) arrêts sinoauriculaires intermittents (bursts) atrial arrhythmias arythmies auriculaires bloc AV 3ème degré (intermittent) bloc AV 3ème degré (intermittent) block AV 3/1, 3/2 block AV 3/1 block AV 2/1 block AV 2/1 0 5 10 15 20 25 30 échappement ventriculaire min aucune fibrillation aucune extrasystole ventriculaire aucune dissociation électromécanique Wenckebach 0 10 20 30 40 50 min arythmies durantl’anoxie arythmies durant laréoxygénation

23. Conclusion 1 • L’ECG embryonnaire ressemble à celui de l’adulte. • Le cœur embryonnaire répond rapidement et de manière réversible à l’anoxie. • L’oreillette est plus résistante à l’anoxie-réoxygénation que les autres parties du cœur (A>V >CT). • Les arythmies ressemblent à celles du myocarde adulte défaillant. • Leur origine est essentiellement auriculaire.

24. Protection contre les dommages liés à l’ischémie-reperfusion • Reperfusion contrôlée • Antioxydants (piégeurs de ROS/RNS) • Inhibition d’échangeurs de cations(NHE)ou d’anion(HCO3) • Antagonistes des canaux calciques • (réduction de la surcharge en Ca2+) • Activation des canaux KATP mitochondriaux • Préconditionnement ischémique: • courtes périodes d’ischémie (protection précoce ou tardive) • Préconditionnement non-ischémique: • pharmacologique (NO, adénosine, bradykinine…) • pacing à fréquence physiologique

25. GAP (Cx43) CICR (L-type Ca++, RyR) sarc-KATP pace maker conduction couplage E-C contractilité ? ? PKC NO mito-KATP PTP NOS ROS UCP ? ?

26. glibenclamide (1 µM) diazoxide (50 µM) 5-hydroxydecanoate (500 µM) ∆ volume ∆ Ψ ∆ Ca2+ ∆ ATP Modulation pharmacologique des canaux KATP mitochondriauxet sarcoplasmiques sarcKATP ∆ Vm sarcolemme mito-KATP ∆ ROS mitochondrie -180 mV m.i. m.e.

27. L’activation des canaux mitoKATP augmente la production de ROS à la réoxygénation, exclusivement * # 7 7 7 6 5 4 contrôle DMSO DIAZO non-traité 5-HD GLIB DIAZO +5-HD PREANOXIE 0.5 0 REOXYGENATION 2 ∆ fluorescence (a.u./sec)x10-3 1.5 1 0.5 0 moyenne ± DS; *:P<0,01vs contrôle DMSO, #:P<0,01 vs DIAZO (test t de Student)

28. ANOXIE REOXYGENATION 450 350 DIAZO(7) DIAZO+5-HD (5) 250 150 * 50 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 Temps in vitro (min) GLIB(4) 400 Contrôle(6) 5-HD(5) 300 200 100 0 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 Temps in vitro (min) L’activation des canaux mitoKATP accélère la récupération postanoxique du couplage excitation-contraction. Contrôle DMSO(7) délai électro- mécanique ventriculaire (% préanoxique) moyenne ± ESM *: P<0,01 DIAZO vs contrôle DMSO et DIAZO+5-HD ANOVA mesures répétées

29. CICR (L-type Ca++, RyR) E-C coupling E-C coupling + 5-HD, glibenclamide diazoxide ROS MPG1mM GAP (Cx43) sarc-KATP pace making conduction conduction contractility mito-KATP

30. 0.5 0 2 1.5 1 0.5 0 contrôle DMSO DIAZO DIAZO+MPG Le MPG abolit la production de ROS induite par le DIAZO PREANOXIE REOXYGENATION * ∆ fluorescence (a.u./sec) x10-3 # 7 7 4 moyenne ± DS; *:P<0,01vs contrôleDMSO, #:P<0,01 vs DIAZO (test t de Student)

31. ANOXIE REOXYGENATION 450 Contrôle DMSO(7) 400 DIAZO(7) 350 DIAZO+MPG (4) 300 250 200 150 100 * 50 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 Temps in vitro (min) Le MPG abolit la protection du couplage E-C apportée par l’activation des canaux mitoKATP délai électro- mécanique ventriculaire (% préanoxique) moyenne ± ESM; *: P<0,01 DIAZO vs contrôle DMSO et DIAZO+MPG ANOVA mesures répétées

32. GAP CICR (L-type Ca++, RyR) pace making conduction conduction E-C coupling contractility + 5-HD, glibenclamide PKC diazoxide chelerythrine 5M ROS GAP (Cx43) sarc-KATP mito-KATP

33. 0.5 0 2 * 1.5 1 0.5 0 control DMSO DIAZO DIAZO+CHEL L’inhibition des PKC ne modifie pas la production de ROS induite par DIAZO PREANOXIE * REOXYGENATION ∆ fluorescence (a.u./sec) x10-3 7 7 6 moyenne±DS; *:P<0,01vs contrôleDMSO (test t de Student)

34. ANOXIE REOXYGENATION 450 Contrôle DMSO(7) 400 DIAZO(7) 350 DIAZO+CHEL(4) 300 250 200 150 100 * 50 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 Temps in vitro (min) L’inhibition des PKC abolit la protection du couplage E-C apportée par l’activation des canaux mitoKATP. délai électro- mécanique ventriculaire (% préanoxique) moyenne ± ESM *: P<0,01 DIAZO vs contrôle DMSO et DIAZO+CHEL ANOVA mesures répétées

35. GAP CICR (L-type Ca++, RyR) pace making conduction contractility E-C coupling + 5-HD, glibenclamide PKC diazoxide NO NOS ROS L-NAME 50µM GAP (Cx43) sarc-KATP mito-KATP

36. 0.5 0 REOXYGENATION 2 * 1.5 1 # 0.5 0 contrôle DMSO DIAZO DIAZO+L-NAME L’inhibition des NOS abolit la production de ROS induite par DIAZO PREANOXIE ∆ fluorescence (a.u./sec) x10-3 7 7 5 moyenne ± DS; *:P<0.01vs control DMSO, #:P<0.01 vs DIAZO (test t de Student)

37. ANOXIE REOXYGENATION 450 Contrôle DMSO(7) 400 DIAZO(7) 350 DIAZO+L-NAME (5) 300 250 200 150 100 * 50 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 Temps in vitro (min) L’inhibition des NOS abolit la protection du couplage E-C par diazoxide. délai électro- mécanique ventriculaire (% préanoxique) moyenne ± SEM *: P<0.01 DIAZO vs contrôle DMSO et DIAZO+L-NAME ANOVA mesures répétées

38. Conclusion 2 Dans le modèle du cœur embryonnaire/fœtal, l’ouverture des canaux mitoKATP améliore la récupération post-anoxique du couplage excitation-contraction ventriculaire exclusivement. Cette protection est liée à une augmentation de la production de ROS induite par l’ouverture des canaux mitoKATP et à l’activation consécutive des PKC. Le NO semble être indispensable à cette protection.

39. Cx L-type Ca++ SR RyR MAPK: JNK, ERK, p38 gap j. couplage E-C conduction MPG CHEL ROS PKC profilspatiotemporel d’activation (O,V,CT): - activité Kinase - Immunoblotting WB - Immunohistochimie ? DIAZO mitoKATP I DIAZO NOS NO II MYXO 5-HD L-NAME NOSmt III L-NAME IV NO m.i. m.o. m.s. UCP MPTP

40. REMERCIEMENTS Eric Raddatz

41. Pavel Kucera Norbert Lange Stéphany Gardier Christophe Bonny Fabienne Maurer

42. André Singy Christian Haeberli Anne-Catherine Thomas Tout le personnel du Département de Physiologie et du Département de Génétique Médicale

43. Mes amis Mes parents Et Esther.

46. 40 35 30 Température (°C) 25 20 15 10 5 0 220 180 140 Heart Rate (bpm) 100 60 20 550 450 350 250 150 50 600 500 400 300 200 100 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 Time in vitro (min) PR interval (ms) QT duration (ms)

47. atrial EMD heart rate 30 180 160 20 ms bpm 140 10 120 ventricular EMD 25 160 PR interval 140 ms 15 ms 120 5 100 ventricular shortening QT duration 45 180 35 ms 140 25 mm 100 15 Les paramètres fonctionnels sont stables 3h in vitro 0 60 0 60 30 90 120 150 180 30 90 120 150 180 time in vitro (min) stabilization time in vitro (min) 25°C 37°C 25°C 37°C

48. - - - - - - . . . . . . O2 O2 O2 O2 O2 O2 . OH . NO . NO La mitochondrie représentela source principale de ROS sources extra-mitochondriales mitochondrie NAD(P)H-oxydases Nox 1-5 Fe2+ + H-W: H2O2 chaîne respiratoire H2O (IV) (III) (II) (I) NOS ONOO- O2 (peroxynitrite) O2 O2 O2 cascade AA H2O2 mtNOS (cyclo-, lipoxygénases) réticulum endoplasmique (microsomes; cyt p450) - . O2; H2O2 peroxysomes

49. 3.5 98% O2 3 2.5 2 21% O2 1.5 Fluorescence DCFH (u.a.) 1 0% O2 0.5 0 30 60 90 120 Temps in vitro (min) La fluorescence du DCFH est dépendante de la pO2

50. L’hyperoxie augmente la production radicalaire à la réoxygénation (DCFH 10µM) O2 21% N2 98% Réoxygénation 2.5 O2 98% 2 1.5 O2 21% Fluorescence (u.a) 1 ? 0.5 0 0 1800 3600 5400 7200 Temps (min)