GENOMA E NUTRIÇÃO

1. CLAUDIA MARIA MEIRELLES MARCHINI GENOMA E NUTRIÇÃO

2. Genoma • É a informação genética pertencente a uma célula ou um organismo • Genoma humano apresenta aproximadamente 25 mil genes

3. Projeto Genoma humano • Mapeamento do genoma humano • Identificação dos nucleotídeos • Aproximadamente 1,5% do genoma codificam proteínas • Seqüências genoma que não codificam proteínas consistem RNA, seqüências regulatórias, íntrons e “junk” DNA

4. Ômicas: novas ciências * Genoma * Transcriptoma * Metaboloma * Nutrogenoma * Proteoma * Lipidoma Outras Ômicas…

5. Interação Nutriente – Gene • Objetivo: estabelecer dietas personalizadas com base no genótipo para promover a saúde diminuindo os riscos de doenças crônicas (cardiovasculares, diabetes, câncer...) • É fundamental a aplicação na área da nutrição das ferramentas da genômica funcional para a análise do transcritoma, do proteoma e do metaboloma. • Aplicabilidades: cultura de células, modelos experimentais em animais, estudos pré-clínicos e clínicos

6. Ciências Nutricionais • Galactosemia é um defeito genético na enzima GALT, levando a um acúmulo de galactose no sangue • Fenilcetonúria é um defeito genético na enzima fenilalanina-hidrolase, levando a um acúmulo de fenilalanina • Deficiências de vitaminas como a B12, ácido fólico, B6, C, E, ferro ou zinco causam dano no DNA quebrando a dupla-fita • A deficiência de nutrientes pode explicar porque ¼ da população dos Estados Unidos que não consome as 5 porções diárias recomemdadas de vegetais e frutas tem um risco 2 X maior de desenvolverem câncer

8. Nutrigenômica “Caracterizauma nova visão do estudo de alimentos e dapesquisanutricionalnaqual a avançadatecnologiafuncionalgenômica é usada, aolado de técnicasnutricionais e bioquímicas, paradeterminaremosmecanismospelosquaisosalimentos e seuscomponentesindividuaismodulamprocessosqueocorremnostecidos do corpohumano”. Instituto de Pesquisa de Alimentos, 2001

9. Abordagem molecular: Estudo entre as interações dos nutrientes com os genes e o efeito na saúde do indivíduo

11. Nutrientes atuam em transdução de sinal • Chá verde • Polifenol • 11-epigallocatechin-3-gallate (EGCG) • Inibe NF-kappaB fator de transcrição

12. Porque individuais respondem de forma diferenciada a uma dieta especifica? Variabilidade genética!

13. Antes Mutações * Durante as cercas de 1016 mitoses possíveis durante uma vida humana, em cada LOCUS podem ocorrer 108 a 1010 mutações Depois Antes Luz ultra-violeta

14. Mutações * Alteração permanente e transmissível na seqüência de nucleotídeos em um gene que pode causar a alteração ou a perda da função normal. A T C G T A C G G A T C GGA C G G T A G C C T G C C A T C G T A C G G T A G C C T G C C A T C G T A C G G Replicação | |||||| | | U A G C C U G C C U A G C A U G C C T A G C A T G C C A T C G T A C G G T A G C A T G C C Transcrição RNA: Proteína:

15. Tipos de Mutação Sem Sentido TAC CAC GTG ATA TAC CCC GTG ATT AUG GUG CAC UAU AUG GGG CAC UAA MET VAL HIS TYR MET GLY HIS STOP ... !

16. Tipos de Mutação Sentido Trocado TAC CAC GTG CAC TAC CCC GTG CAC AUG GUG CAC GUG AUG GGG CAC GUG MET VAL HIS LEU MET GLY HIS LEU

17. A estrutura da proteína permite que sua função seja executada. Alteração em sua estrutura afetará sua especificidade ou atividade.

18. Modificações das Bases Nitrogenadas Radiação Ionizante * Formação de dímeros de Pirimidina * Interrupção da replicação * Seqüências truncadas

19. Mutagênicos Químicos * Alguns mutagênicos químicos modificam a estrutura molecular das bases. * No caso dos agentes alquilantes, são adicionados grupos etil ou grupos metil

20. Mutagênicos Químicos Structuresofdietarymutagens Ferguson & Philpott. TheannualReviewofNutrition, 28:12.1-12.17, 2008.

21. Aflatoxina B1 * Produzida pelo fungoAspergillusflavus

22. Aflatoxina B1 * Populações expostas a esta molécula tem alto índice de hepatocarcinoma * 50% dos casos de hepatocarcinoma apresentam mutação no gene p53 Transversão GC TA

23. Polimorfismo Single Nucleotide Polymorphism (SNP) * Variação em uma seqüência de DNA em um único nucleotídeo * Deve ocorrer em ao menos 1% da população

24. Como são detectadas as diferenças entre os indivíduos? • O brócolis possui algum efeito na expressão genética na dieta? • Experimento por um mês utilizando a Dieta A (enriquecida por Brócolis) e Dieta B (ausência de Brócolis outras hortaliças semelhantes) • Sujeitos: gêmeos idênticos saudáveis

25. Microarranjo • DNA microarray, DNA chip, genome chip, expression chip e gene array • São vendidoscomercialmenteporempresas de biotecnologia Aproximadamente 10.000 pontos/cm2

26. DNA Microarray Cadapontorepresenta um gene distinto

27. Extração RNA • O RNA é separado com auxílio de uma centrífuga , a velocidade alta separa os componentes da solução dependendo do tamanhooudensidade RNA Proteína, DNA e outroscomponentes

28. RNA total • RNA mensageiro • RNA transportador • RNA ribossômico

29. Isolamento do mRNA • Colunas contendo pequenas esferas recobertas por poli-T que se ligamsomente com mRNA quepossuemcaudapoli-A Pequenasesferas constituem a coluna Aumento de umaesfera

30. Retenção do mRNA nacoluna • As fitas de mRNA ficaramretidasnasesferaspoli-T pormeio das caudaspoli-A

31. Recuperação do mRNA • Como liberar o mRNA das esferas? • O pareamento de bases entre moléculas de DNA é comprometidoporconcentrações de sais e pH

32. Produção de uma cópia de cDNA fluorescente • Montagem de uma fita complementar de DNA oposta a molécula de mRNA Solução Fluoresncenteverde Dieta A Dieta B Solução fluorescente vermelha

33. Conteúdoda solução fluorescente • Primers Poli-T: unem-se as cadeiaspoli-A dos mRNA • Transcriptase reversa: umaenzimaquesintetiza a fita de cDNA • Nucleotídeosfluorescentes: serãoincorporadosna nova molécula de cDNA

34. Aplicação do cDNAs marcados com fluorescência • Transcriptase reversa produz cDNAfluorescente e moléculas de mRNA foramdegradadas com RNAses

35. cDNAsquenãohibridaram cDNAsvermelhos hibridaram com esteponto cDNAsverdes hibridaram com esteponto cDNAsvermelhos e verdeshibridaram Com esteponto

36. Leituradaplaca de microarray • O scanner lê um fluoróforo por vez; • O programafazumasobreposição das imagens; • O importantesãoospontosverdes e vermelhosisolados

37. Exemplo de aplicação do microarray • Uma linhagem celular de carcinoma de cólon foi tratada com sulforafona • Composto bioativo de brócolis Resultado: • Indução da expressão do 106 genes • Inibição da expressão de 63 genes • Atividade anticarcinogênica

38. Limitações • Necessidade de quantidades significativas de tecido para o isolamento de mRNA. • Necessidade de repetições para obter valor significativo • Alto custo da técnica • O tratamento com nutrientes específicos promovem, geralmente, pequenas alterações na expressão gênica, dificultando a análise dos resultados • Baixa reprodutibilidade utilizando-se plataformas de diferentes fabricantes

39. Doença inflamatória intestinal (IBD) • Inflamação crônica do trato gastrointestinal • Colite ulcerativa (UC) • Doença de Crohn (CD) • Sintomas: diarréia, cólica abdominal, febre e sangramento • Tratamento: remédios que controlam os sintomas, mas não curam a doença; dieta controlada

40. Doença inflamatória intestinal (IBD)

41. Genes envolvidos no estabelecimento da IBD • Reconhecimento de bactérias • Na modulação da resposta inflamatória • No transporte de moléculas na mucosa intestinal

42. I) Genes envolvidos no reconhecimento de bactérias Proteína NOD2 Proteção contra bactérias invasivas

43. II) Genes envolvidos na modulação da resposta imunológica Afetam Resposta Imune Autoimunidade

44. III) Genes envolvidos no transporte de moléculas na mucosa intestinal Transdução de Sinal Intracelular

45. Dieta na doença inflamatória intestinal • A IBD pode ser controlada com uma dieta elemental, que parece modular a ação de citocinas e mudar a microbiota do intestino • Desafios: não existe um grupo de alimentos que seja benéficos ou causem danos a todos os pacientes. A dieta de eliminação é usada para se verificar as necessidades individuais

46. Perspectivas IBD • Omega-3 pode reduzir os sintomas da inflamação; Chá verde pode regular a expressão de proteínas transportadoras • Porém o gene de interesse deve estar funcionando normalmente no paciente • A identificação dos genes levam ao desenvolvimento da doença e assim permitir uma abordagem mais específica • Dietas específicas poderiam aliviar os sintomas e curar até 90% dos pacientes

47. Concluindo • Nutrientes alteram processos moleculares, expressão genética e metabolismo • Variações genéticas individuais podem influenciar como os nutrientes são assimilados • Ferramentas moleculares estão sendo empregadas para examinar a resposta individual aos nutrientes • A nutrigenômica irá desenvolver dietas personalizadas para prevenir o surgimento de doenças e manter a saúde humana

48. OBRIGADA PELA ATENÇÃO cmmarchini@gmail.com