Biossensores de DNA

“Aplicações Analíticas de Eletrodos de Pasta de Carbono Quimicamente Modificados em Soluções de Guanina” Robson Pinho da Silva Orientadora: Profª Drª Sílvia Helena Pires Serrano Laboratório de Bioeletroanalítica

Biossensores de DNA • Sensor de hibridização • Matriz para imobilização enzimática

Podem ser utilizados para: Eletrodos Quimicamente Modificados com DNA • Caracterizar o comportamento redox e o desenvolvimento de metodologia analítica para quantificação de compostos de interesse biológico. • Caracterizar a interação entre Fármacos-DNA. Neste caso o fármaco tem o DNA como molécula alvo in vivo. Brett et al. Electroanal., 8 (11) 992 - 995 (1996).

Sítios de oxidação da bases

DNA degradado DNA Dupla Hélice Eletrodo Modificação dos Eletrodos com DNA V.P.D. registrados com EPC/DNA. Solução de DNA degradado 80 µg mL-1 em tampão acetato pH 4,5. Em vermelho branco apenas em tampão.  = 5 mV s-1, E = 50mV, larg. de pulso = 70 ms. Brett et al., In Comprrensive Chemical Kinetics;, Vol.37., Cap.3, pag.91 –119, R.G. Compton e G. Hancock (Editores), Oxford University Press, Oxford, 1999 Inglaterra

Aplicações: • Identificação dos mecanismos de interação entre intermediários de redução dos nitrocompostos e o DNA . • Os sítios preferenciais de ataque dos intermediários de redução dos nitrocompostos são as bases purínicas (adenina e guanina)

Objetivos Preparar Eletrodos Quimicamente Modificados a partir desta bases. Desenvolvimento de Metodologia Analítica No estudo do mecanismo de interação com Fármacos – Bases purínicas

Primeira base utilizada foi a Guanina Eletrodos Quimicamente Modificados • Analitos de Interesse: NADH, NADPH, Ácido Úrico e 8-oxo-Guanina • Moléculas que via de regra, causam envenenamento superficial devido à adsorção dos produtos de oxidação.

O- O- P P O- O- O- O- NADH e NADPH

NADH e NADPH: São cofatores enzimáticos • Determinação de Atividade Enzimática. • Esclarecimento do mecanismo de Ação Enzimática • Desenvolvimento de Biossensores para substratos não eletroativos ou com eletroatividade em valores extremos de potencial

Ácido Úrico • Um dos principais produtos finais do catabolismo de purinas (guanina e adenina) • Componente fisiológico associado aos sintomas de algumas doenças por exemplo a gota.

8-oxo-guanina: • O maior produto de degradação oxidativa do Dna. Usado como traçador biológico de estresse oxidativo. • Altos níveis dessa substâncias podem estar associados à incidência de câncer.

Experimental Eletrodos de trabalho: • Pasta de carbono, (EPC) • Pasta de carbono modificado em solução de Guanina (EPC/G) • Pasta de carbono modificado em solução de 8-oxo-guanina (EPC/8-OXO).

Eletrodo de referência: • Ag/AgCl (KCl sat.) • Eletrodo auxiliar: • Pt. • Equipamentos: • Potenciostato/ Galvanostato: Eco Chemie, Autolab, modelo PGSTAT 20 e aquisição de dados pelo software GPS 3.1. • pH-metro: modelo 654, Eletrodo de vidro combinado 6.0205.100 ( OE ), ambos da Metrohm.

Modificação de eletrodos de trabalho: • Solução de Guanina 50 mM em tampão universal pH 8,0 • Solução de 8-oxo-guanina 50 mM em tampão universal pH 8,0 • 12 min. de condicionamento a 0,2 V; 0,4 V ou 1,1 V, sob agitação.

Medidas voltamétricas dos analitos • Solução tampão PIPES pH 7,0 • Faixas de concentração: 15 a 824 M para 8-oxo-guanina e 7,5 a 841 M para os demais. • Voltamogramas de pulso diferencial (D.P. V.) • 0,0  Eapl 1,0 V •  = 5 mV s-1; • E = 50 mV • larg. de pulso = 70 ms.

RESULTADOS EXPERIMENTAIS Para otimização das etapas de preparação dos Eletrodos modificados utilizou-se como analito apenas o NADH

D.P.V. registrados em solução de 420 Mde NADH em PIPES pH 7,0 em EPC/G . (____) Modificado em solução de guanina a 0,42 V durante 12 min.; (____) Modificado em solução de guanina a 1,1 V durante 12 min. Silva R. P. e Serrano S. H. P., J. of Pharm. and Biom. Anal.33, 735 – 744 (2003).

Qual a participação da 8-oxo-guanina na modificação do eletrodo?

c a b m 3 A 0,2 0,4 0,6 0,8 0,2 0,4 0,6 0,8 0,2 0,4 0,6 0,8 E / V E / V E / V Figura 2:V.D.P. registrados em solução de 420 M NADH em tampão PIPES pH 7,0 com: (a) (EPC/8-oxo) modificado à 0,2 V (b) (EPC/8-oxo) modificado à 1,1 V . (c) (EPC/g ) modificado à 1,1 V.

Como comprovar que a superfície do eletrodo foi totalmente modificada?

D.P.V. registrados em solução tampão PIPES, pH 7,0 (brancos) com: (___ )(EPC)sem modificação; (___ )(EPC/G) a 1.1 V (___ )(EPC/8-oxo) modificado a 0,2 V.; (___ )(EPC/8-oxo) modificado a 1,1 V; (durante 12 min.)

V.P.D. registrados com (EPC ) modificado em tampão HAc/NaAc, pH 4,5 branco a 1,1 V durante 12 min. em solução: (1)tampão HAc/NaAc, pH 4,5(2)50 M solução de guanina (5º volt.); (3) tampão HAc/NaAc, pH 4,5, após 2

D.P.V. registrados em solução tampão HAc/NaAc, pH 4,5 branco a 1,1 V durante 12 min. com : (1) EPC modificado em Guanina 5 x 10-5 tampão HAc/NaAc, pH 4,5(2)EPC modificado em Guanina 5 x 10-4 tampão HAc/NaAc, pH 4,5

O pH da solução de Guanina influencia o processo de modificação do eletrodo?

O pH da solução de Guanina influencia o processo de modificação do eletrodo? Figura 4:V.P.D. registrados em solução 420 M deNADH (PIPES pH 7,0)(___)(EPC/G pH 4,5),(___)(EPC/g pH 7,0) e (___) (EPC/G pH 8,0)

14 adições no intervalo de concentração : 7,5 x 10-6 M  NADH  8,1 x 10-4 M Em cada adição foram realizados 3 voltamogramas Comparações entre os D.P.V. registrados em concentrações crescentes de NADH em tampão PIPES pH 7,0 : EPC e EPC/G .

Curvas Analíticas para NADH

Comparações entre as curvas de adição de padrão de NADH, Ip vs. [NADH] : 1a série, 2a série, 3a série e 4a série (A) (EPC); B) (EPC/G);

Faixa de concentração : 7,5 M  NADPH  810 M Comparações dos V.P.D. em concentrações crescentes de NADPH em tampão PIPES pH 7,0 : EPC e EPC/G .

Comparações entre as curvas de adição de padrão de NADPH, Ip vs. [NADPH] : 1a série, 2a série, 3a série e 4a série(A) (EPC); (B) (EPC/G);

Faixa de concentração : 7,5 M  Ác. Úrico  810 M Comparações dos D.P.V. em concentrações crescentes de Ácido Úrico em tampão PIPES pH 7,0 : (A) (EPC/G pH 8,0); (B) (EPC) .

Faixa de concentração : 15 M  8-oxo-guanina  840 M Comparações dos D.P.V. em concentrações crescentes de 8-oxo-guanina em tampão PIPES pH 7,0 : (EPC/G) e (EPC) .

CONSIDERAÇÕES FINAIS

EPC/G podem ser utilizados para determinação de NADH, NADPH, Ác. Úrico ou 8-oxo-guanina

Comparação entre EPC/G e EPC

Apresenta resultados mais reprodutíveis A superfície modificada: • Evita adsorção dos produtos de oxidação de NADH e NADPH, Ácido Úrico e 8-oxo-guanina • Favorece o processo de transferência de elétrons

No eletrodo modificado em guanina o processo é controlado por difusão

Gráfico de I vs. 1/2 obtido pela corrente limite dos voltamogramas cíclicos na diversas velocidade de rotação com: (A) EPC/G (B)EPC; concentrações de NADH: (a) 0,29 mM; (b) 0,55 mM; (c) 0,78 mM,(d) 1,00 mM; (e) 1,20 mM.

A provável composição para superfície modificadora é uma estrutura formada por dímeros ou trímeros formado por guanina e 8-oxo-guanina;

(1) A. M. O. Brett, S. H. P. Serrano e J. A. P. Piedade, “Electrochemistry of DNA”. In:Comprehensive Chemical Kinetics - Book Series, Vol.37., Cap.3, pag.91 –119, R.G. Compton e G. Hancock (Editores), Oxford University Press, Oxford, 1999 Inglaterra • (2) R. Srinivasan, J. C. Murphy e R. Faichtein, J. Electroanal. Chem, 312, 293-300 (1991). • (3) N. J. Tao e Z. Shi, J. Phys. Chem, 98, 1464-1471 (1994). • (4) N. J. Tao e Z. Shi, J. Phys. Chem, 98, 7422-7426 (1994)

Mecanismo de oxidação

Modificação do Eletrodo • Em potencias positivos (+1,4V ) as bases purínicas (guanina e adenina) do DNA degradado em solução são oxidadas na superfície do eletrodo recoberto com filme de DNA modificando-o de forma permanente e dando origem a uma fase condutora. V.P.D. registrados com EPC/DNA. Solução de DNA degradado 80 µg mL-1 em tampão acetato pH 4,5. Em vermelho branco apenas em tampão.  = 5 mV s-1, E = 50mV, larg. de pulso = 70 ms.

Biossensores de DNA