Citologie şi Histologie Practică

1. Citologie şi Histologie Practică Curs 2

2. Diagnosticul citologic • Simplu, ieftin, repetabil. • Scop principal: leziunea este sau nu malignă. • Studiul citologiei exfoliative : la mijlocul secolului XIX • În 1843 Walshe face referire la mici fragmente expectorate cu caracter malign (tumori de tract respirator). • În 1847 Pouchet face primele referiri asupra citologiei vaginale normale. • În 1860 Beale face primele referiri asupra celulelor descuamate în context diagnostic (sputa la o tumoră faringiană). • 1864 Sanders : citologia urinară la pacienţii cu tumori vezicale. • 1927 Babeş arată pentru prima oară că este o metodă utilă pentru diagnosticul cancerului de col uterin înainte de invazie (articol publicat). • 1928 Papanicolaou publică un articol pe aceeaşi temă. • 1940 intră în atenţia lumii medicale ajutat de Charles Cameron (directorul medical şi ştiinţific al Societăţii Americane de Cancer) care popularizează testul PAP. Aurel Babeş

3. Raportul citologic - principii • Foarte importantă tehnica efectuării frotiurilor • Fără descriere macroscopică. • Sunt importante datele clinice primite de la clinician. • Citodiagnosticul se referă la caracterul malign sau benign al celulelor. • Nu face referiri asupra formei histopatologice de tumoră. • Nu face referiri legate de stadiu şi gradul tumoral (G) • Citodiagnosticul negativ nu infirmă existenţa tumorii. • Nu aduce informaţii prognostice şi terapeutice. • Citologia nu substituie examenul histopatologic. • Metode speciale de coloraţie ?

4. Principiile de bază ale interpretării şi raportării citologiilor • Diagnosticul citologic este considerat atât ştiinţă cât şi artă. • Este adeseori mai dificil decât diagnosticul histopatologic. • Diagnosticul citologic are la bază o sinteză a întregului ansamblu şi nu doar modificări ale celulelor individuale. • Datele clinice sunt indispensabile. • Uniformitatea metodelor tehnice din fiecare laborator. • Diagnosticul citologic se bazează adesea pe modificări minore (nucleare şi/sau citoplasmatice). • Sistemul de raportare (sistemul Bethesda) are valoare din punct de vedere epidemiologic şi în cercetare, dar uneori privează patologul de flexibilitate în diagnostic. • Este foarte importantă cunoaşterea caracterelor celulare normale

5. Istoric • Georgios Nicolas Papanicolaou (1883-1962) • Kymi (Grecia) • 1898 – Universitatea din Atena • 1904-1906 asistent medical în armată • Începe cariera medicală – bolnavii de lepră • 1907 – Institut de Zoologie din Munchen • 1910 – obţine doctoratul • 1912 – locotenent în corpul medical al armetei • 1914 – N.Y. în departamentul de Anatomie • 1920 – începe studiul citologiei vaginale • 1943 – publică monografia • Februarie 1962 – insuficienţă cardiacă cu EPA.

6. Citologie? De unde? • Toate zonele anatomice • Citologia exfoliativă • Citologia abrazivă • Puncţie aspirativă cu ac fin • Citologia sanguină şi a măduvei hematogene

7. Citologia exfoliativă • Se bazează pe desprinderea spontană a celulelor, de la suprafaţa unor organe, la nivelul unor cavităţi. • Celulele exfoliate sunt recoltate prin metode non-abrazive. • Nu poate fi stabilită vârsta celulelor exfoliate. • Diagnostic precoce în tumori cu localizare superficială. • Exemple: • Citologia vaginală • Citologia sputei • Citologia seroaselor • Citologia urinară

8. Citologia exfoliativă- citologia vaginală- • Citologia vaginală • Evaluează celule din zona fundului de sac posterior al vaginului, care provin din mai multe surse. • Adesea conţine pe lângă celule epiteliale descuamate şi alte tipuri celulare: • leucocite şi macrofage (cresc numeric în procesele inflamatorii) • diverse microorganisme

9. Citologia exfoliativă • Citologia sputei - colecţie de material mucoid care conţine celule provenite din: • cavitatea bucală • faringe • laringe • trahee • arborele bronşic • alveolele pulmonare • Citologia urinară • Citologia seroaselor

10. Citologia seroaselor • Lichidul este colecţionat în containere sterile şi transferat rapid în laborator. • Stocare posibilă la 4 grade Celsius (maxim 2 zile) • Volum satisfăcător : aproximativ 50 ml • Se adaugă în container peste lichidul de evaluat o soluţie fixatoare (etanol 50%). • Regulă: soluţia fixatoare trebuie sa aibă acelaşi volum (sau puţin mai mare) cu lichidul pentru evaluare • Dacă sunt lichide cu conţinut hemoragic se adaugă în plus şi un anticoagulant (heparină) • Necesar 2 frotiuri/caz pentru diagnoastic • Centrifugare uzual la 600 rotaţii timp de 10 minute. • Lichidele decelabile clinic/imagistic: patologice

11. Citologia exfoliativă- caracteristici - • Citologia exfoliativă se caracterizează de prezenţa celulelor din diverse surse. • O caracteristică importantă: slaba păstrare a unor tipuri celulare exfoliate • unele celule se păstrează relativ bine (ex. celulele scuamoase) • Altele se alterează uşor (ex. celulele glandulare, leucocitele) • Necesară fixarea rapidă

12. Citologia abrazivă • Metoda este utilizată pentru a obţine prin abraziune, un număr sporit de celule direct de pe suprafaţa unui organ. • Spatula cervicală a fost introdusă de Ayre în 1947. • Permite recoltarea celulelor de la nivelul epiteliului exocervical şi endocervical • Alte instrumente pentru citologia exfoliativă

13. Citologia abrazivă

14. Frotiu de sânge periferic • Frotiul de sânge periferic (venos sau capilar) • sânge “capilar“ - arteriolar • Strat subţire, uscare rapidă la temperatura camerei • Colorare • Metoda de elecţie: May-Grünwald-Giemsa (MGG) • Alternative: Wright, Romanowsky • Metode citochimice: peroxidaza, fosfatazele, PAS • Metode imunocitochimice: markeri leucocitari de membrană • Examinare • Obiectiv x40 sau x100 (imersie) • Se urmăreşte: • aspectul general al frotiului • morfologia eritrocitelor • formula leucocitară

15. Frotiu de sânge periferic • Frotiul de sânge periferic (venos sau capilar) • sânge “capilar“ - arteriolar • Strat subţire, uscare rapidă la temperatura camerei • Colorare • Metoda de elecţie: May-Grünwald-Giemsa (MGG) • Alternative: Wright, Romanowsky • Metode citochimice: peroxidaza, fosfatazele, PAS • Metode imunocitochimice: markeri leucocitari de membrană • Examinare • Obiectiv x40 sau x100 (imersie) • Se urmăreşte: • aspectul general al frotiului • morfologia eritrocitelor • formula leucocitară Recoltare la nou-născut şi copilul mic

16. Frotiu de sânge periferic • Frotiul de sânge periferic (venos sau capilar) • sânge “capilar“ - arteriolar • Strat subţire, uscare rapidă la temperatura camerei • Colorare • Metoda de elecţie: May-Grünwald-Giemsa (MGG) • Alternative: Wright, Romanowsky • Metode citochimice: peroxidaza, fosfatazele, PAS • Metode imunocitochimice: markeri leucocitari de membrană • Examinare • Obiectiv x40 sau x100 (imersie) • Se urmăreşte: • aspectul general al frotiului • morfologia eritrocitelor • formula leucocitară

17. Sânge venos Sânge capilar

18. Frotiu din aspiratul medular şi/sau biopsie • Aspiratul şi biopsia – cresta iliacă postero-superioară (corticală subţire) • sigură • riscul scăzut de durere • accesibilitate bună • Alternative: • Creasta iliacă antero-superioară • Doar aspirat: • Stern : • peste 12 ani, obeze • Nivelul corespunzător celui de-al 2-lea şi al 3-lea spaţiu intercostal • Tibie: • la copii sub 1 an (anestezie generală) • Suprafaţa proximală anteromedială

19. Frotiu din aspiratul medular şi/sau biopsie • Aspiratul şi biopsia – cresta iliacă postero-superioară (corticală subţire) • sigură • riscul scăzut de durere • accesibilitate bună • Alternative: • Creasta iliacă antero-superioară • Doar aspirat: • Stern : • peste 12 ani, obeze • Nivelul corespunzător celui de-al 2-lea şi al 3-lea spaţiu intercostal • Tibie: • la copii sub 1 an (anestezie generală) • Suprafaţa proximală anteromedială

20. Puncţia aspirativă cu ac finFNA (Fine Niddle Aspiration) • Diagnosticul tumorilor palpabile • 1853 James Paget – diagnosticul tumorilor mamare. • Menetrier (1886) şi Kronig (1887) diagnosticul tumorilor pulmonare. • Câteva centre specializate. • În 1925 Martin şi Coley se implică în diagnosticul preoperator (peste 1000 cazuri) • Mamare • Ganglion limfatic • Plămân • Os • Institutul Karolinska (Suedia) – Nils Soderstrom şi Josef Zajicek • Tumori mamare, prostatice, tiroidiene, glande salivare, pulmonare • Prezent: tumori localizate profund • Ghidaj: eco, CT

21. FNA: avantaje • Nu impune pregătire specială • Fără anestezie specifică • Elimină perioadele de “aşteptare” • Rapidă, sigură • Nedureroasă • Ieftină • Raportarea FNAB: • nesatisfăcător • benign • malign • suspicios

22. Realizarea preparatelor citologice • Fixarea este o etapă foarte importantă • Pentru cele mai multe cazuri, preparatele bine fixate şi colorate adecvat sunt mai uşor de interpretat decât cele care sunt uscate la aer. • Trebuiesc preparate frotiuri în strat subţire şi cu material uniform întins. • Prepararea materialelor citologice prin periere sunt mai dificil de efectuat. • Exceptând cazurile când este necesară uscarea preparatului la aer (ex. frotiurile sanguine), restul preparatelor citologice necesită fixare rapidă cu soluţie fixatoare specifică. • Cel mai utilizat fixator pentru coloraţia Papanicolaou: alcool 95% • Durata optimă a fixării: 15 minute • Există şi fixatori tip spray. • În cazul frotiurilor uscate se poate realiza rehidratarea acestora: • soluţie apoasă de glicerină – 3 minute • 2 băi de alcool etilic 95% • etapele coloraţiei Papanicolaou

23. Coloraţiile fundamentalecoloraţia Papanicolaou (1942) • Fixare în alcool etilic 95% - 15 min • Apă distilată – 1 min • Hematoxilină Harris – 6 min • Apă distilată – 2 minute • Se scufundă de 6 ori în soluţie apoasă de acid clorhidric 0,25% • Apă curgătoare – 6 minute • Limpezit în apă distilată (câteva secunde) • Soluţie alcol etilic de 50%, 70%, 80% şi 95% (câte 1 min) • Colorare cu OG6 – 1,5 min • Alcool 95% (2 băi a 0,5 min) • Colorare cu EA – 1,5 min • Limpezire în alcool 95% (3 băi a câte 1 min) • Deshidratare cu alcool etilic 100% - 1 min • Amestec alcool-xilen (1:1) – 1 min • Xilen – 1 min • Montare balsam de Canada • Durata totală : • 45 min preparatele nefixate • 30 min preparatele fixate

24. Coloraţiile fundamentalecoloraţia APT-Drăgan (1968) • Colorare cu soluţia AP (albastru policrom) – 15 sec • Spălare în două băi de apă distilată sau de robinet – 15 sec • Diferenţiere în soluţia T (tanin 1%) – 15 sec • Spălare în apă distilată sau de robinet – 15 sec • Montare balsam de Canada Carte : Citodiagnostic cu metoda de colorare rapida APT-Drăgan; Editura de Vest, 2004 • Durata totală : 60 sec

25. Imunocitochimia • Are un mare potenţial de utilizare. • Cazuri selectate. • Imunocitochimia este utilă în 70% din cazuri. • Lichid pleural: pentru diferenţierea celule mezoteliale vs tumori metastatice (utilă în 82% din cazuri). • Carcinom urotelial vs carcinom prostatic invadant în vezică/uretră. • În cazul FNA este utilă la 69% din cazuri. • Fixarea optimală impune: • uscare preparatelor, • apoi plasarea în soluţie de formol salin 0,1% peste noapte la 27grade C • plasare în etanol 100% timp de 10 minute

26. Criterii de malignitate celulară • Se bazează pe: • modificările structurale ale celulelor • interrelaţiile perturbate dintre celule • Diagnosticul histopatologic : se bazează în primul rând pe modificările arhitecturale. • Diagnosticul citologic : se bazează pe modificări ale celulelor individuale. • Aspectul morfologic al celulelor de pe preparatele citologice diferă semnificativ de cele evaluate pe preparatele histopatologice. • Din acest motiv sunt necesare criterii de diagnostic citologic • Criterii de malignitate: • generale • modificări structurale ale celulei (nucleu, citoplasmă) • modificări ale interrelaţiei cu alte celule (pentru grupuri de celule) • criterii indirecte • specifice

27. Criterii generale de malignitate1- modificări structurale celulare- modificări nucleare - • Creştere disproporţionată a nucleului cu alterarea raportului N/C • Normal: celule endocervicale, din pelvisul renal • Hipercromazia • modificări degenerative • supracolorare • Pattern cromatinian aberant: • Elongat • Contur neregulat • Identaţii profunde • Lobulaţie • Creşterea dimensiunii şi a numărului nucleolilor • Multinucleere • Activitate mitotică cu mitoze atipice • Normal: eroziuni cervicale, exudat • Îngroşarea membranei nucleare • Modificări degenerative: vacuolizări anormale

28. Criterii generale de malignitate1- modificări structurale celulare- modificări citoplasmatice - • Accentuarea bazofiliei sau acidofiliei • acidofilia în special pentru carcinomul scuamocelular • apare şi în leziuni non-tumorale • Incluziuni citoplasmatice: pigment, leucocite, resturi celulare • Melanina (melanom malign) • Incluziuni leucocitare (adenocarcinoame) • Vacuolizări atipice în special în adenocarcinoame • observate şi în celule non-maligne (normale sau patologice) (ex: celule endometriale)

29. Criterii generale de malignitate1- modificări structurale celulare- modificări generale celulare - • Creşterea dimensiunii celulare peste limita normală acceptată • Hipertrofia celulară se poate întâlnii şi în condiţii normale (ex: celule endocervicale, pelvisul renal, celule prostatice) • Aspecte aberante ale formei celulare cu elogări şi forme bizare • celula fibră • Modificări necrotice şi degenerative

30. Criterii generale de malignitate2- bazate pe interrelaţii celulare • Iregularităţi de pattern – lipsa uniformităţii în ceea ce priveşte orientarea celulei şi a nucleilor • Anizokarioză şi anizocitoză • Se referă la variaţii ale dimensiunilor nucleare şi celulare de acelaşi tip dintr-un grup celular • nu se referă la variaţiile de mărime ale celulelor individuale de pe frotiu • Lipsa limitei celulare distincte • prezentă şi în celulele normale (ex: celule endometriale) • fixarea improprie • Aglomerări de celule şi nuclei • Normal în celulele endometriale • Canibalismul celular • Formare de pattern-uri particulare • Rozetă (adenocarcinoame)

31. Criterii generale de malignitate3- indirecte • Prezenţa sângelui cu eritrocite degenerate • Absent în stadiile iniţiale ale proceselor maligne • Excesul de limfocite (specimenele de spută şi lavajul bronhoalveolar) • În agregate largi • Număr crescut de histiocite • Adenocarcinomul endometrioid • şi în condiţii normale

32. Clasificarea frotiurilor(clasificarea Papanicolaou) • C I : - absenţa celulelor normale şi atipice • C II : - citologie atipică dar fără evidenţa aspectelor de malignitate • C III : - citologie sugestivă dar nu concluzivă pentru malignitate • C IV : - citologie puternic sugestivă pentru malignitate • C V : - citologie concluzivă pentru malignitate

33. Clasificarea frotiurilor cervico-vaginale(clasificarea Bethesda) • Frotiu normal (corespunde C I) • ASCUS (celule atipice scuamoase fără semnificaţie cunoscută); AGUS (celule atipice glandulare fără semnificaţie cunoscută) (corespunde C II) • LGSIL (neoplazia intraepitelială de grad scăzut)(corespunde C III) • HGSIL (neoplazia intraepitelială de grad crescut) (corespunde C IV) • Cancer (corespunde C V)