EL ANALISIS MOLECULAR DEL DNA HA SIDO POSIBLE MEDIANTE EL CLONADO DE DNA

1. EL ANALISIS MOLECULAR DEL DNA HA SIDO POSIBLE MEDIANTE EL CLONADO DE DNA TEJIDOVECTORES mRNA DNA cDNA DNA digerido (doble cadena metilado) DNA CLONABLE LIGACION DNA-VECTOR DNA RECOMBINANTE INTRDUCCION EN CELULA HUESPED LIBRARY (Screening-subclonado)

2. VECTORES Construidos a partir de plásmidos y bacteriófagos naturales Caracteristicas 1) REPLICON ESTABLE : Posee secuencias que permiten su propagación 2) MCS: (multiple cloning site) sitio para insertar el DNA a clonar- Posee sitios únicos para varias ER 3) MARCADORES DE SELECCIÓN: Confieren propiedades fenótípicas a la célula huesped.

3. TIPOS DE VECTORES 1) VECTORES DE CLONADO- Aislamiento de fragmentos de DNA 2) VECTORES DE EXPRESION- Expresión de genes clonados 3) VECTORES ESPECIALES- Permiten estudio de promotores y secuencias regulatorias de la expresión génica

4. TIPOS DE VECTORES DE CLONADO • PLASMIDOS: Límite clonado 0.1- 10 Kb • FAGOS: Derivados del bacteriófago Lambda, 8-25 Kb • COSMIDOS: Combinación fago ly plásmido, 35-50 Kb • BAC (Bacterial Artificial Chromosomes) Derivados plásmido F, 75-300 Kb • Vectores derivados de Bacteriofago P1 , 100 Kb • YAC (Yeast artificial Chromosome) cromosoma de levaduras artificial, 100-1000 Kb

5. PLASMIDOS • Molécula DNA doble cadena circular extracromosomal que replica en forma autónoma dentro de la bacteria (1.6-300 Kb) • FUNCIONES CODIFICADAS POR LOS PLASMIDOS • Resistencia a antibióticos • Degradación de compuestos orgánicos (Pseudomonas) • Producción de toxinas (ej E.coli enterotoxinas) • Producción de bacteriocinas (colicinas, subtilicinas) • Inducción de tumores (plantas) • Sistemas de Restricción-modificación • Producción de antibióticos (ej Streptomyces) • Resistencia a metales pesados

6. CLASIFICACÓN DE PLASMIDOS • Nº DE COPIAS: Alto o bajo Nº de copias. El Nº de copias depende del tipo de ori de replicación 30 Replicones diferentes Bajo Nº de copias:1-5 copias Alto Nº de copias : 20-40 copias (hasta 300 copias) • CONJUGATIVOS O NO • GRUPO DE COMPATIBILIDAD

7. Dirección de DNA replicación RNAasa H RNAII -500 -400 -300 -200 -100 ori 100 200 300 400 500 600 rop gen RNAI Rop proteina (63 aminoácidos) REPLICACION ColE1 REPLICACION pMB1 o ColE1 : plásmidos multicopia 30 copias

8. ori -555 -265 -20 REPLICACION Clivaje por RNAasa H RNAII primer ori RNAII primer Clivaje por RNAasa H Rop NO REPLICACION RNA I

9. Grupos de compatibilidad Grupo de compatibilidad: set de plásmidos cuyos miembros son capaces de coexistir en la misma bacteria Plásmidos incompatibles: cuando NO pueden ser diferenciados uno del otro en algún aspecto que es esencial para su mantenimiento: ori de replicación y/o sistema de segregación Sistema de segregación: proteínas que permiten la segregación de los plásmidos en las células hijas

11. PLASMIDOS -VECTORES DE CLONADO CARACTERISTICAS 1) ORI (derivados de ColE1) 2) POLILINKER (MCS) 3) MARCADORES DE SELECCIÓN 4) SECUENCIAS PARA SCREENING: b-Galactosidasa

12. MARCADORES DE SELECCION Permiten la selección de aquellas células que poseen el vector : - Marcadores de resistencia a antibioticos - Marcadores de auxotrofía (permiten S! de un componente esencial ej aminoácidos) Antibioticos, ej: Ampicilina , Tetraciclina , Kanamicina, Zeocina

13. Ampicilina: Interfiere con síntesis de pared bacteriana Resistencia: gen bla b-lactamasa Tetraciclina: Inhibe síntesis de proteínas por unión a subunidad ribosomal 30s Resistencia: gen tet proteínaque se une a membrana bacteriana y impide transporte del antibiótico Kanamicina: Se une a ribosomas 70s , produce misreading del mRNA Resistencia: gen kan aminoglicosido fosfo transferasa modifica el antibiotico Zeocina: Se intercala al DNA gen zeo proteína que se une a antibiotico y evita su unión al DNA

14. pBR322

15. pUC19

17. FAGOS FILAMENTOSOS

20. Trasformación

23. CLONADO EN PLASMIDOS DIGESTION ER : Plásmido y DNA a clonar LIGACION (in vitro, ligasa) TRANSFORMACION ( bacterias competentes) SELECCIÓN SCREENING

27. TRANSFORMACION Y SELECCION TRANSFORMACION Bacterias competentes: Métodos químicos: Cl2Ca, DMSO, etc Eficiencia:107 cel/mg DNA Métodos físicos: Electroporación (pulsos electricos ) Ef: 108cel/mg DNA SELECCIÓN Presión de selección : crecimiento en presencia de antibiótico

28. SCREENING • Screening : para detectar la mólecula de plásmido que posee inserto • b-galactodiasa (no es concluyente) • Mapeo de restricción • PCR (colony PCR) • Hibridización in situ en la colonia con sonda específica

31. LIBRARY TEJIDOVECTORES mRNA DNA cDNA DNA digerido (doble cadena metilado) DNA CLONABLE LIGACION DNA-VECTOR DNA RECOMBINANTE INTRDUCCION EN CELULA HUESPED LIBRARY cDNA o genómica Screening y subclonado

32. Fago l

34. Formación de placa de lisis

36. Selección 1) CI lisogenia CI lisis Cepas hfl- No proteasa degrada CII S! CI lisogenia . Fagos CI D forman placas de lisis en cepas hfl- 2) red gam (genes involucrados en recombinación ) l fenotipo Spi+ (sensible a interferencia P2) l red-gam- fenotipo Spi- ,replican en cepas lisogenas P2(rec+).

38. Preparación de flibrary en fago l 1

39. 2

40. Screening library en fago l

41. Library de expresion Screening

42. VECTOR l ZAP

43. SINTESIS DE cDNA SINTESIS 1ER CADENA 5´cap AAAAAA(A)nA 3´ mRNA oligodT (12-18) primer AAAAAA(A)nA dATP dTTP dGTP dCTP Transcriptasa reversa AAAAAA(A)nA AAAAAA(A)nA cDNA:mRNA

44. SINTESIS DE cDNA SINTESIS 1ER CADENA 5´cap AAAAAA(A)nA 3´ mRNA Random primers AAAAAA(A)nA dATP dTTP dGTP dCTP Transcriptasa reversa AAAAAA(A)nA AAAAAA(A)nA cDNA:mRNA

45. SINTESIS DE cDNA SINTESIS 2ª CADENA 1) AAAAAA(A)nA cDNA:mRNA dNTPs RNAasa H + DNA pol cDNA doble cadena

46. cDNA Sintesis Transferasa terminal 2) AAAA mRNA RT oligodT TTTTT AAAA degrad. RNA TTTTT Transferasa Terminal dCTP TTTT Klenow pol dNTPs- oligoG AAAAA TTTTTT CCCC GGGGG CCCCC

47. En este caso el clonado permitido es NO direccionado. Si en síntesis de la primera cadena de cDNA se usa un oligo T con secuencia para ER1 y luego al cDNA se unen los adaptadores con sitio para ER2 , al cortar con las dos enzimas se podrá clonar direccionalmente.