L’estrazione del DNA

1. L’estrazione del DNA Classe 2-3 ragioneria Prof. Aldo Marinelli

2. Le fasi dell’esperimento L’esperienza prevede l’estrazione del DNA dal frutto del kiwi. Questo esperimento si divide in 4 fasi: 1. Demolizione della struttura cellulare 2. Digestione delle proteine, in particolare degli istoni (proteine associate alla molecola del DNA). La digestione delle proteine è la loro demolizione fino ad aminoacidi. 3. Precipitazione del DNA 4. Osservazione al microscopio

3. 1- Demolizione della struttura cellulare Pesiamo 3 g di cloruro di sodio e li mettiamo nel cilindro graduato. Il cloruro di sodio, dissociato negli ioni Na+ e Cl- agirà sugli istoni, che sono proteine legate al DNA. Prepariamo 10 ml di detergente e versiamo nel cilindro con il cloruro di sodio. Il detergente agirà sulle membrane cellulari del nucleo e della cellula stessa.

4. Aggiungiamo acqua distillata fino ad un volume di 100 ml. Agitiamo bene per sciogliere il sale.

5. Sbucciamo due kiwi per un totale di circa 100 g di polpa di frutta e la schiacciamo con una forchetta.

6. Versiamo la poltiglia nel pallone e ci aggiungiamo la soluzione di estrazione preparata

7. Mettiamo il pallone in acqua a 60° C per 15 minuti. In questo modo l'alta temperatura faciliterà la rottura delle membrane e disattiverà gli enzimi che attaccano il DNA.

8. Quindi raffreddiamo il preparato in ghiaccio per non protrarre l'alta temperatura che potrebbe frammentare il DNA.

9. Filtriamo con un colino e un filtro, il preparato in un pallone pulito.

10. 2- Digestione delle proteine Preleviamo 5 ml di filtrato e lo mettiamo in una provetta da almeno 15 ml. Aggiungiamo 1 ml di succo di ananas ed agitiamo bene. Nel succo di ananas è contenuta la bromelina, enzima che demolirà le proteine e che libererà definitivamente il DNA dagli istoni. Attendiamo pochi minuti in modo che la bromelina contenuta nel succo di ananas agisca sulle proteine degradandole.

11. 3- Precipitazione del DNA Prendiamo un volume di etanolo ghiacciato uguale a quello del filtrato più succo di ananas (6 ml)… …e lo versiamo lungo il bordo della provetta con attenzione in modo da formare uno strato sulla superficie del filtrato. Il DNA, molto solubile in acqua, precipiterà nell'etanolo.

12. Sul momento si formano delle bollicine di gas (nella provetta si verifica un abbassamento della temperatura con conseguente liberazione dei gas prima disciolti): aspettiamo che termini il fenomeno. A questo punto è possibile osservare nell'interfaccia acqua-alcol una sostanza trasparente che va via via aumentando: è il DNA.

13. Il DNA che prima si trovava in soluzione nell'acqua ora si trova a contatto con l'etanolo; in questo ambiente il DNA non è solubile quindi diventa ben visibile. Il DNA di kiwi è frammisto a numerose bollicine di aria liberate dall'alcool in via di riscaldamento.

14. 4. Osservazione al microscopio Con un lungo filo metallico terminante in un uncino, estraiamo un po' di DNA dalla provetta e lo poniamo sopra ad un vetrino da microscopia. Osservando questo preparato al microscopio, non ci aspettiamo di vedere la famosa struttura a doppia elica del DNA. Neanche con un microscopio elettronico si riesce a vederla. Vedremo invece dei fiocchetti alquanto confusi, vagamente filamentosi.