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P C R. Juan López Marfull Octubre 2011. La reacción en cadena de la polimerasa. Herramientas de Ingeniería Genética. Enzimas de restricción Plasmidios Clonación de ADN Electroforesis Reacción en cadena de la Polimerasa. ¿Qué es la PCR?.

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Presentation Transcript

  1. PCR Juan López Marfull Octubre 2011 La reacción en cadena de la polimerasa

  2. Herramientas de Ingeniería Genética • Enzimas de restricción • Plasmidios • Clonación de ADN • Electroforesis • Reacción en cadena de la Polimerasa

  3. ¿Qué es la PCR? • Es una amplificación de un trozo específico de ADN. • Es una técnica que aumenta la misma cantidad de ADN mediante la reacción en cadena de la enzima polimerasa. • Se trata de copiar una y otra vez un mismo fragmento de ADN, realizando in vitro lo que las células hacen in vivo. • Descrita en 1986 por el bioquímico KaryMullis.

  4. La lectura de las bases del ADN comete 1 error por cada 2 mil millones de bases.

  5. El modelo ADN – Polimerasa

  6. Reacción en Cadena de la Polimerasa • Fundamentos • Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN empleando ciclos alternados de altas y bajas temperaturas.

  7. Reacción en Cadena de la Polimerasa • Requerimientos • ADN molde (Secuencia génica blanco) • Dos cebadores (o primers) • Desoxinucleósidos trifosfatos (dNTPs) • ADN polimerasa. • Termociclador • Procedimiento • Con calor, desenrollar y disociar pares de bases de ADN. • Añadir primers, nucleótidos y polimerasas. • Enfriar la solución para provocar la síntesis del ADN copia. • Repetir lo anterior las veces que sea necesario.

  8. Lo primero …

  9. ADN de cebolla Extracto de cebolla Separación de sólidos

  10. Lo segundo … Se trata de disponer en tubos Eppendorf el ADN de la especie objeto de estudio. Además debemos añadir en dicho tubo un par de oligonucleótidos que actúen como cebadores para la ADN polimerasa. La elección de estos oligonucleótidos (primers) es crucial dado que han de delimitar la región a amplificar. En concreto, deben ser complementarios a cada uno de los extremos 3´ de la región a amplificar

  11. Lo tercero … Llevar los trozos de ADN al termociclador. Disponer de Iones de Magnesio como un cofactor de la polimerasa. Programar el termociclador.

  12. Pasos de la PCR Disociación: Se calienta la muestra hasta 95ºC, por un minuto y medio. Así se abren las dos cadenas del ADN blanco. Alineamiento. La solución se enfría hasta 55ºC (dependiendo de la secuencia de los primers y su especificidad). La duración de este paso puede oscilar entre ½ minuto y 2 minutos. Extensión. Se vuelve a aumentar la temperatura hasta los 72ºC y se deja actuar a la Polimerasa durante 1 ó 2 minutos. Se sintetizarán copias complementarias de cada cadena.

  13. El termociclador

  14. Laboratorio de Análisis del Servicio Médico Legal en Santiago de Chile. 2010

  15. Con la PCR ha sido posible secuenciar los genes del proyecto HUGO (Human Genome Organization). Con esta información podemos hacer bancos de genes, bibliotecas de genes, diagnosticar enfermedades genéticas, detectar provirus incrustados en el genoma, etc.

  16. Otras aplicaciones • Test de paternidad • Diagnosis de morbo genético • Clonación de genes • Comparación de genomas para filogénesis • Análisis de ADN fósil o de detenidos desaparecidos • Genotipado de mutaciones específicas • Identificación de especies • Determinación de distancias taxonómicas • Tipaje HLA para inmunoensayos

  17. Otra aplicación interesante de la PCR es la amplificación de ADN “ancestral” que permite el análisis de muestras preservadas de cientos de miles de años, por ejemplo de insectos de 40 millones de años, preservados en ámbar, hojas fósiles de magnolia de 17 millones de años, mamuts conservados en los glaciares. La PCR permite hacer comparaciones evolutivas entre los seres de la antigüedad y sus descendientes de nuestros días como son los mamuts y los elefantes.

  18. Un Taller de Genética dirigido por el Premio Nacional de Ciencias Aplicadas, Pablo Valenzuela, recibieron al presidente Ricardo Lagos y líderes de opinión chilenos en Julio de 2004. La meta era copiar una parte específica de ADN. Con la técnica PCR, los participantes obtuvieron unos 35 millones de copias de un gen en un tubo de ensayo. Con ellas, cada grupo secuenció el fragmento de ADN.

  19. ¿Quién inventó la PCR? El Premio Nobel en Química de 1993 La Real Academia Sueca de Ciencias premió a Kary B. Mullisbioquímico de EEUU, por su invención del metodo de la Polymerase Chain Reaction (PCR) en el año 1985. La patente de la RPC es propiedad de los laboratorios Roche, desde 1994.

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