Identyfikacja taksonomiczna mikroorganizmów

1. Identyfikacja taksonomiczna mikroorganizmów

2. Identyfikacja taksonomiczna mikroorganizmów Identyfikacja taksonomiczna mikroorganizmu - określenie przynależności badanego organizmu do odpowiedniej jednostki taksonomicznej, najczęściej gatunku • Gatunek - populacja mikroorganizmów wykazujących wysoki stopień podobieństwa w ściśle określonym zakresie cech, a różniących się od innych gatunków tego samego rodzaju

3. Identyfikacja taksonomiczna bakterii • Szczep – grupa drobnoustrojów potomnych jednej komórki • Szczep referencyjny – izolat danego gatunku opisany jako pierwszy i najlepiej scharakteryzowany (wzorzec) • Gatunek – wiele szczepów podobnych w ściśle określonym zakresie cech • Gatunek – grupa szczepów, w tym szczep referencyjny, wykazujących co najmniej 70% homologii pełnego genomowego DNA

4. Identyfikacja taksonomiczna bakterii • Gatunek – grupa szczepów różniących się zawartością G+C w genomowym DNA nie więcej niż o 3% molowe nG + nC % G+C = x 100% nA + nT + nC + nG • W obrębie rodzaju różnice w %mol G+C nie mogą przekroczyć 10%

5. Cechy umożliwiające identyfikację bakterii • morfologia • skład chemiczny ściany komórkowej • obecność inkluzji komórkowych i substancji zapasowych • zdolność do tworzenia pigmentów • sposób odżywiania • wymagania pokarmowe • źródła C, N, S • skład jakościowy i ilościowy produktów fermentacji • wymagania tlenowe • zakres temperatur i pH wzrostu • wrażliwość na antybiotyki • patogenność • zależności symbiotyczne z innymi organizmami • środowisko występowania • obecność określonych antygenów (charakterystyka immunologiczna) • sekwencja DNA genomowego

6. Metody identyfikacji mikroorganizmów Podział metod identyfikacji mikroorganizmów: a) biochemiczne b) biofizyczne c) biologii molekularnej d) immunochemiczne

7. Metody biochemiczne Polegają na określeniu zdolności mikroorganizmów do asymilacji, fermentacji lub rozkładu określonych związków chemicznych • cechy biochemiczne określa się na podstawie reakcji chemicznych zachodzących w odpowiednio skomponowanych pożywkach wzrostowych • wyniki testów biochemicznych odczytuje się makroskopowo • wzrost lub jego brak • zmiana zabarwienia pożywki • reakcja barwna po wprowadzeniu odczynnika reagującego z wytwarzanym metabolitem • wytworzenie gazu

8. Testy biochemiczne Naniesienie Zawieszenie INKUBACJA (18 – 48 h) Interpretacja wyników w teście API (bioMerieux)

9. Metody biofizyczne Umożliwiają identyfikację taksonomiczną mikroorganizmów poprzez oznaczanie produktów ich metabolizmu lub wybranych związków wchodzących w skład struktur komórkowych • Techniki elektroforetyczne • Techniki oparte na chromatografii gazowej

10. Identyfikacja drobnoustrojów za pomocą technik elektroforetycznych • Analiza profili białkowych • skład ilościowy i jakościowy wszystkich białek komórkowych Sposób postępowania: • izolacja białek komórkowych • rozdział elektroforetyczny w żelu poliakrylamidowym • barwienie rozdzielonych białek • porównanie z profilami białkowymi bazy danych Metoda pozwalająca określić przynależność gatunkową mikroorganizmu

11. Identyfikacja drobnoustrojów za pomocą technik elektroforetycznych Elektroforeza dwukierunkowa

12. Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu o chromatografię gazową • Analiza profili kwasów tłuszczowych pochodzących z lipidów ściany komórkowej • skład kwasów tłuszczowych jest unikalny i charakterystyczny dla każdego gatunku mikroorganizmu przy zachowaniu kontrolowanych warunków hodowli • zarówno ilościowy, jak i jakościowy skład ściany komórkowej bakterii kodowany jest przez DNA genomowe i nie ma na niego wpływu informacja genetyczna zawarta w plazmidach • Analiza jakościowa – obecność specyficznych kwasów tłuszczowych • Analiza ilościowa – określenie zawartości poszczególnych kwasów tłuszczowych

13. Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu o chromatografię gazową Sposób postępowania: • saponifikacja i uwolnienie kwasów tłuszczowych • metylowanie • ekstrakcja z fazy wodnej • rozdział z zastosowaniem chromatografii gazowej • analiza wyników i porównanie z bazą danych Metoda pozwalająca określić przynależność gatunkową mikroorganizmu

14. Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu o chromatografię gazową Microbial Identification System HP 5898 A firmy HewlettPackard

15. Metody biologii molekularnej Metody identyfikacji oparte na badaniu homologii fragmentów kwasów nukleinowych • Metody hybrydyzacyjne • Metody oparte o technikę PCR

16. Metody hybrydyzacyjne Polegają na zastosowaniu tzw. sond genetycznych • sondy są to krótkie jednoniciowe fragmenty DNA, zawierające sekwencje unikalne dla danego organizmu • kwas nukleinowy pełniący rolę sondy genetycznej jest znakowany • radioaktywnym fosforem [32P] lub wodorem [3H] • barwnikiem fluorescencyjnym • enzymem

17. Metody hybrydyzacyjne • Najpopularniejsze systemy detekcji wykorzystująsondy DNA komplementarne do charakterystycznych dla identyfikowanego mikroorganizmu sekwencji rybosomalnego RNA (rRNA) • Wykorzystanie rRNA zwiększa czułość oznaczenia, gdyż występuje on w komórce bakteryjnej w dużej liczbie kopii (od 1 000 do 10 000) • Inną zaletą tego rozwiązania jest dostępnośćinformacji odnośnie sekwencji rRNA pochodzącychod różnych, często bardzo blisko genetyczniespokrewnionych mikroorganizmów, dzięki czemumożliwe jest otrzymywanie sond o bardzo wysokiejspecyficzności

18. Metody hybrydyzacyjne Dot blot

19. Metody hybrydyzacyjne Southern blotting

20. Metody hybrydyzacyjne • homologia kwasów nukleinowych powyżej 60% świadczy o przynależności organizmu do określonego gatunku • stopień hybrydyzacji powyżej 20% wskazuje na zgodność identyfikowanego drobnoustroju z danym rodzajem • hybrydyzacja od 1 do 5% może zachodzić między DNA lub RNA organizmów niespokrewnionych

21. FISH – hybrydyzacja fluorescencyjna in situ Umożliwia identyfikację mikroorganizmów widzianych pod mikroskopem

22. FISH – hybrydyzacja fluorescencyjna in situ Wynik FISH dla mieszaniny wybranych bakterii z rodzaju Bacillus, Escherichia, Pseudomanas, Shigella

23. Metody wykorzystujące technikę PCR Technika PCR (Polymerase Chain Reaction) - enzymatyczna amplifikacja (zwielokrotnienie) in vitro specyficznej sekwencji nukleotydów • gen kodujący 16S rRNA mikroorganizmów prokariotycznych • gen kodujący 18S rRNA mikroorganizmów eukariotycznych Sposób postępowania: • amplifikacja fragmentu DNA • sekwencjonowanie • porównanie wyników z danymi zamieszczonymi w banku genów • 5% różnica w sekwencji wystarczy dla wyodrębnienia gatunku

24. Metody wykorzystujące technikę PCRbadanie mieszanej populacji mikroorganizmów

25. Metody wykorzystujące technikę PCR • Geny kodujące białka bakteryjne • białko szoku termicznego Hsp 70 • białko szoku termicznego Hsp 60 • syntaza asparaginylo-tRNA • syntaza alanylo-tRNA • dehydrogenaza glutaminianowa • hydrolaza pirofosforanu • podjednostka β polimerazy RNA (RpoB) • podjednostka β’ polimerazy RNA (RpoC) • czynniki elongacyjne: EF 1α/Tu, EF-Tu, Ef-G/2 • białka rybosomowe: L2, L5, L11, L14, L15, L22, L23, S5, S12 • gyrazy

26. Metody immunochemiczne Reakcja aglutynacji

27. Metody immunochemiczne Test ELISA

28. Metody immunochemiczne Test immunochromatograficzny