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PROTEÍNAS G Y TRANSDUCCIÓN DE LA SEÑAL. D. Arias, A. Nadal, L. Selva, A. Sesé y A. Vidal. TRANSDUCINA. Introducción. Proteínas G monoméricas. Proteínas G heterotriméricas. Superfamília Ras. Ras Rho/Rac Rab Arf Ran. Introducción. CICLO DE UNA PROTEÍNA G HETEROTRIMÉRICA. INACTIVO.
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PROTEÍNAS G Y TRANSDUCCIÓN DE LA SEÑAL D. Arias, A. Nadal, L. Selva, A. Sesé y A. Vidal TRANSDUCINA
Introducción Proteínas G monoméricas Proteínas G heterotriméricas Superfamília Ras Ras Rho/Rac Rab Arf Ran
Introducción CICLO DE UNA PROTEÍNA G HETEROTRIMÉRICA INACTIVO ACTIVO CASCADA SEÑALIZACIÓN EFECTORES
Proteínas reguladoras del intercambio GTP-GDP Reguladores proteína G GEFs (Guanine-nucleotide-exchange factors) Facilita el intercambio GDP GTP GDIs (Guanine-nucleotide-dissociation inhibitors) Inhibe el intercambio GDP GTP GAPs (GTPasa-activating proteins) Facilita la hidrólisis GTP GDP
Introducción Estructura general SUBUNIDAD Gγ SUBUNIDAD Gα SUBUNIDAD Gβ 1GP2.pdb 2.3Ă
Introducción α4 α3 β6 β5 αG β4 αD α5 β1 α2 β3 αB αA α1 β2 αF αE αC • α/β • 5 hélice-α (1-5) que rodean a una hoja β de 6 cadenas (1-6) Plegamiento subunidad Gα Dominio GTPasa Dominio helicoidal • Todo α • Hélice-α central (αA) rodeada de 5 hélices-α antiparalelas Linker II Linker I
Introducción Gα - Switch Switch III Switch II Switch I 1GP2.pdb 2.3Ă
1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 Switch 1 Switch 2 Switch 3 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 Introducción CLUSTALW de las subunidades Gα 1 2 3 4 5 6 7 (1) 1AZS 2.3A (Gs, Bos); (2) 1CTJ 1.1A (Gs, Bos); (3) 1GG2 2.4A (Rattus, Gi); (4) 1AGR 2.8A (Rattus, Gi); (5) 1GIT 2.6A (Rattus,Gi); (6) 1TAD 1.7A (Bos, Gt); (7) 1TAG 1.8A (Bos, Gt);
Introducción Plegamiento subunidad Gβ S6 S7 S5 S1 N-terminal C-terminal β1 β2 β3 S4 β4 S2 S3 Dominios WD-40 1GP2.pdb 2.3Ă
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 Introducción CLUSTALW de subunidades Gβ WD1 WD2 WD2 WD4 WD5 WD5 WD6 WD7 (1) Bos SBTAP00000000259; (2) Canis ENSCAFP00000016683; (3) Gallus ENSGALP00000002038; (4) Homo ENSGALP00000002038; (4) Saccharomyces YOR212W; (5) Mus ENSMUSP00000024206
Introducción Plegamiento subunidad Gγ N-terminal de Gγ N-terminal de Gβ Cadena polipeptídica 1GP2.pdb 2.3Ă
Introducción CLUSTALW de subunidades Gγ
Introducción PROTEÍNA:Transducina PROTEÍNA G HETEROTRIMÉRICA - Clasificación CLASE:Proteínas alfa y beta (a/b) PLEGAMIENTO:P-loop que contiene hidrolasa de nucleótidos trifosfato SUPERFAMÍLIA:P-loop que contiene hidrolasa de nucleótidos trifosfato FAMÍLIA:Proteínas G Gαs Gαq/11 Gαi Gα12/13 1GP2.pdb 2.3Ă
Introducción TRANSDUCINA Transducina Rodopsina Fosfodiesterasa 6 Ciclo de la transducina Ciclo de la rodopsina Ciclo de laPDE
Transducina Subunidad α Subunidad γ Subunidad α Subunidad γ Subunidad β Subunidad β Switch I / II / III (α) 1GOT.pdb 2.0Ă
N-terminal Gα - Gβ Switch I/II - Gβ Interacción subunidad α – subunidad βγ PUNTOS DE CONTACTO 1GOT.pdb 2.0Ă
Interacción subunidad α – subunidad βγ 1GOT.pdb 2.0Ă
Interacción subunidad α – subunidad βγ Switch I/II - Gβ 1GOT.pdb 2.0Ă
Interacción subunidad α – subunidad βγ Switch I/II - Gβ
Interacción subunidad α – subunidad βγ PHE195 ILE180 TRP99 PHE211 TRP207 LEU117 MET101 CYS210 TYR59 HIS209 Switch I/II - Gβ 1GOT.pdb 2.0Ă
Thr 178 OG1 Asn 119 ND2 Ile 180 NH Leu 117 O Ile 180 Leu 117 Glu 182 OE1 Trp 99 NE1 Arg 193 NH2 Ser 98 OG Phe 195 Trp 99 Gly 199 O Asn 119 OD1 Gln 200 NE2 Tyr 145 NH Gln 200OE1 TThr 143 O Arg 201 NH Asp 186 OD1 Glu 203 N Asp 228 OD1 Lys 206 NZ Trp 207 Met 101 Enlace H Interacción iónica Contactos vdW His 209 Trp 332 Cys 210 Tyr 59 Phe 211 Lys 57 NZ Glu 212 OE1
Interacción subunidad α – subunidad βγ N-terminal Gα - Gβ 1GOT.pdb 2.0Ă
Interacción subunidad α – subunidad βγ N-terminal Gα - Gβ
Interacción subunidad α – subunidad βγ ALA23 LEU55 ASP22 LYS78 LEU19 GLU16 ILE80 SER12 LYS89 N-terminal Gα - Gβ Leu 55 Ala 23 Lys 78 NZ Asp 22 OD1 Lys 78 Leu 19 Ile 80 Leu 15 Lys 89 Glu 16 OE2 Lys 89 NZ Ser 12 OG Lys 89 NH 1GOT.pdb 2.0Ă
Interacción subunidad α – subunidad γ • -Estado activo: forma abierta. El dominio helicoidal hace una rotación lejos del sitio de unión del nucleótido. El loop α-b y α-c y la hélice α-A están abiertos. • Estado inactivo: forma cerrada. El dominio helicoidal hace una rotación hacia el sitio de unión del nucleótido. El loop α-b y α-c y la hélice α-A están más cerca.
α4 α3 β6 β5 αG β4 αD α5 β1 α2 β3 αB αA α1 β2 αF αE αC Interacción subunidad α – GDP/GTP Subunidad α Dominio GTPasa Dominio helicoidal PDB: 1TAG 1.80Å
1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 Switch 1 Switch 2 Switch 3 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 Subunidad alfa ALINEAMIENTO BASADO EN SECUENCIA (Clustalw) 1 2 3 4 5 6 7 (1) 1AZS 2.3A (Gs, Bos); (2) 1CTJ 1.1A (Gs, Bos); (3) 1GG2 2.4A (Rattus, Gi); (4) 1AGR 2.8A (Rattus, Gi); (5) 1GIT 2.6A (Rattus,Gi); (6) 1TAD 1.7A (Bos, Gt); (7) 1TAG 1.8A (Bos, Gt);
Switch 1 Switch 2 Switch 3 ALINEAMIENTO BASADO EN ESTRUCTURA RMS 1.22 (1) 1AZS 2.3A (Gs, Bos); (2) 1CTJ 1.1A (Gs, Bos); (3) 1GG2 2.4A (Rattus, Gi); (4) 1AGR 2.8A (Rattus, Gi); (5) 1GIT 2.6A (Rattus,Gi); (6) 1TAD 1.7A (Bos, Gt); (7) 1TAG 1.8A (Bos, Gt); SUBUNIDADES ALFA
Subunidad alfa • 1AZS 2.3A (Gs, Bos); • (2) 1CTJ 1.1A (Gs, Bos); • (3) 1GG2 2.4A (Rattus, Gi); • (4) 1AGR 2.8A (Rattus, Gi); • (5) 1GIT 2.6A (Rattus,Gi); • (6) 1TAD 1.7A (Bos, Gt); • (7) 1TAG 1.8A (Bos, Gt); Superposición de subunidades alfa de diferentes tipos de transducina
Switch 1 Switch 2 Switch 3 SECUENCIAS CONSENSO GXXXXGK(S/T) GAGESGKS Dominio de unión del Pβ DxXGG DVGG Dominio de unión del Pγ Cambio conformacional GDP/GTP NXXD NKKD Especifidad por la guanina (C/S)A[X]X CAT SUBUNIDADES ALFA
Interacción subunidad α – GDP/GTP Dominios de unión Gα Loop α1 – β1: Dominio de unión Pβ Motivo: GAGESGKS Linker 2 Switch II: Loop efector Linker β3 – α2 Switch II Dominio de unión del Pγ Motivo: DVGG Loop β5 – α4: Dominio de unión de la guanina Motivo: NKKD
Interacción subunidad α – GDP/GTP α -GDP α - GTP PDB: 1TAG 1.80Å PDB: 1TND 2.20Å
Interacción subunidad α – GDP/GTP α -GDP α - GTP • Switch I, II, III • Loop αD - βE • Hélice αA - loop αB- αC • Hélice α1 – hairpin β2- β3 – hélice α5
Interacción subunidad α – GDP/GTP Switch I Switch II Switch III Loop αB - αC con hélice αA STAMP: Gα – GDP Gα – GTP Score 8.95 RMS 0.88 Hélice α1, hairpin β2-β3, hélice α5
Interacción subunidad α – GDP/GTP Orientación del interdominio GDP GTP Rotación dominio helicoidal: - 32º sentido contrahorario - Desplazamiento de 2nm Alejamiento del sitio de unión del fosfato en el lugar de unión del nucleótido PDB: 1TAG 1.80Å
Interacción subunidad α – GDP/GTP Switch I Switch II Switch III Loop αB - αC con hélice αA Orientación del interdominio STAMP: Gα – GDP Gα – GTP Score 8.95 RMS 0.88 Hélice α1, hairpin β2-β3, hélice α5
α1 β2 α5 α5 β3 α1 hairpin β2-β3 Interacción subunidad α – GDP/GTP Front to back communication Interacción dinámica: Switch II hélice α5 Via hélice α1 y hairpin β2 - β3 PDB: 1TAG 1.80Å
Interacción subunidad α – GDP/GTP Switch I Switch II Switch III Loop αB - αC con hélice αA STAMP: Gα – GDP Gα – GTP Score 8.95 RMS 0.88 Hélice α1, hairpin β2-β3, hélice α5
Switch III Switch II Switch I Interacción subunidad α– GDP/GTP Regiones switch Regiones switch
Switch III Switch II Switch I Interacción subunidad α– GDP/GTP Regiones switch
Switch III Switch III ARG 201 GLU 241 GLU 232 GLU 241 GLU 232 ARG 204 ARG 201 GLY 199 GLY 199 ARG 204 Switch II Switch II Interacción subunidad α – GDP/GTP Regiones switch Gα-GDP Gα-GTP PDB: 1TAG 1.80Å PDB: 1TND 2.20Å
Switch III ARG 201 GLU 232 GLU 241 ARG 204 GLY 199 Switch II Interacción subunidad α – GDP/GTP Gα-GTP • Puentes de Hidrógeno • ARG 201 – GLU 241 • ARG 204 – GLU 241 • Puentes de Hidrógeno (molécula de H20) • ARG 204 – GLU 232 • GLY 199 – GLU 232
Switch III Switch II Switch I Interacción subunidad α– GDP/GTP Regiones switch
Interacción subunidad α – GDP/GTP Regiones switch Gα-GDP Gα-GTP GLY 198 GLY 199 THR 177 GLY 199 GLY 198 ARG 204 THR 177 GLY 179 Switch II ARG 204 GLY 179 ILE 180 ILE 180 Switch I Switch I Switch II
GTP Pα Pβ P Switch II Mg 2+ GLY 199 THR 177 Switch I Interacción subunidad α – GDP/GTP Gα-GTP: interacción con Pγ y Mg+2 • Puentes de H con el Pγ • G-GTP: • 2 THR 177 (-OH Y –N) • 1 GLY 199 (-NH)
GDP GTP GTP GLY 199 Pα Pβ P Switch II Mg 2+ THR 177 GLY 199 THR 177 GLY 199 THR 177 Switch I Interacción subunidad α – GDP/GTP Gα-GTP: interacción con Pγ y Mg+2 • Puentes con el Mg+2 • G-GDP: • P • SER 43 • 4 H20 • G-GTP: • P • Pγ • SER 43 • THR 177 • 2 H20
Gα-GDP Gα-GTP GDP ARG 174 Pα GTP Pβ GLN 200 GLN 200 Pα THR 177 Pβ ARG 174 P THR 177 Interacción subunidad α – GDP/GTP Actividad GTPasa de la subunidad Gα
GTP GTP GLN 200 Pα Pβ ARG 174 Pα P Pβ THR 177 Pγ ARG 174 GLN 200 THR 177 Interacción subunidad α – GDP/GTP Actividad GTPasa de la subunidad Gα
Transducina Rodopsina Fosfodiesterasa 6 Ciclo de la transducina Ciclo de la rodopsina Ciclo de laPDE Interacción con el receptor