Рекомбинантные белки, современные способы получения и свойства

1. Рекомбинантные белки, современные способы получения и свойства каф. мол. биологии, МГУ 16.10.08

2. Общий метод получения рекомбинантного белка • Молекулярное клонирование гена или его фрагмента • Трансформация клеток, отбор клонов • Выращивание культуры или организма • Выделение и очистка белка

3. Молекулярное клонирование

4. Электропорация 25 мкФ = 2500 В при 200 Ωза 5 мс

5. Отбор клонов protein

6. Использование рекомбинантных белков • Научные исследования – внесение мутаций, гомогенные ферменты, структурные исследования, слитые белки, антигены и т.д. • Все остальное – биотехнологическое применение

9. Рекомбинантные белки для лечения заболеваний: особые требования • Высокая степень очистки • Точная копия природного белка или научные доказательства безопасности мутаций для пациентов • Проверенный, стабильный и безопасный продуцент • Как можно более полное удаление ВСЕХ биополимеров и пирогенов продуцента (ДНК <10 пг/мг) • Раствор или порошок, в котором белок полностью сохраняет свои свойства не менее 1 года • Полная демонстрация стабильности, качества и обоснованности процесса получения – GMP (Good Manufacturing Process)

10. Используемые системы экспресии • Бактерии Esherichia coli и Bacillus subtilis • Дрожжи Saccharomyces cerevisaeи Pichia pastoris • Линии клеток млекопитающих CHO, BHK, A-293 • Трансгенные животные

11. Экспрессионный вектор • Точка инициации репликации- ORI • Селекционные маркеры • Промотор целевого гена • Терминатор транскрипции • Полилинкер - MCS

12. Бактерия Esherichia coli ПреимуществаНедостатки • Быстрый рост (6-12 часов от посева до окончания индукции) • Относительно высокий выход целевого белка (100-2000мг/л) • Низкая цена ростовой среды (натуральные простые компоненты) • Низкая стоимость ферментации • Возможность получать микрокристаллы целевого белка (тельца включения) • Затруднен биосинтез крупных полипептидов(>50 кДа) • Нет системы гликозилирования • Ограниченные возможности секреции белков • Многие гетерологичные белки токсичны для клеток • Затруднено образование дисульфидных связей • Многие гетерологичные белки образуют только тельца включения

13. E.coli – пример системы экспресии • Внехромосомная репликация вектора • Индуцибельный промотор • Специальный штамм • Дополнительный остаток Met[-1] или лидерный пептид • Блок стоп-кодонов

14. E.сoli – варианты систем экспрессии

15. E.coli – примеры использования Белки • Bactericidal/permeability-increasing Protein, • rDNA • Carboxypeptidase, rDNA • G-CSF, rDNA/Amgen • GM-CSF, rDNA/Schering-Plough • Hyaluronidase, rDNA • Insulin-like Growth Factor-1, rDNA/Tercica • Interferon alfa-2a, rDNA • Interferon alfa-2b, rDNA • Interferon alfacon-1, rDNA • Interferon betaser, rDNA/Berlex • Interferon gamma, rDNA • Interleukin-1ra, rDNA • Interleukin-11, rDNA • Interleukin-2, rDNA/Chiron • Keratinocyte growth factor, rDNA • Somatropin, rDNA/ • Somatropin antagonist, rDNA, PEG- • T4 Endonuclease, rDNA, Liposomal • TNF, rDNA • tPA, rDNA/PDL • UrokinasePlasminogen Activator, rDNA Слитые белки • Interleukin-13–Pseudomonas toxin, rDNA • Interleukin-2/diphtheria toxin, rDNA Вакцины • Cholera Vaccine (rDNA)/SBL • Staphylococcus vaccine (rDNA) • Anthrax Vaccine, rDNA/VaxGen • Lyme Vaccine, rDNA/Aventis • Pertussis Toxoid, rDNA Пептиды • Calcitonin, rDNA • Glucagon, rDNA/Lilly • Insulin, rDNA/Lilly • Insulin glargine, rDNA • Natriuretic peptide, rDNA • Parathyroid hormone (1-34), rDNA • Parathyroid hormone (1-84), rDNA Антитела и фрагменты антител • Complement C5 Mab, rDNA • Heat shock protein Mab Mab, rDNA • TNF Mab Fab', rDNA, PEG- • VEGF Mab Fab, rDNA

16. Дрожжи Pichia pastoris ПреимуществаНедостатки • Относительно быстрый рост (3-5 дней от посева до окончания индукции) • Высокий выход целевого белка (до 40г/л) • Очень низкая цена ростовой среды (глицерин, метанол, аммиак) • Умеренная стоимость ферментации • Возможна экспрессия крупных полипептидов (>50 кДа) • Возможно гликозилирование • Секреция белка в ростовую среду, низкий уровень секреции протеаз • N-гликозилирование дает иммуногенные олигосахариды • Не все белки эффективно секретируются • Патентные ограничения на промышленное использование

17. P.pastoris – получение продуцента

18. P.pastoris – схема ферментации

19. P.pastoris – примеры использования • Alfimeprase - Accfib; 3-203-fibrolase (3-serine) (Agkistrodoncontortrix recombinant) • DX-88; ecallantide; kallikrein inhibitor protein, recombinant

20. Линия клеток CHO ПреимуществаНедостатки • Пригодна для белков любого размера • Любые пост-трансляционные модификации • Не содержит трансмиссивных вирусов • Существует сублинияDG44, дефектная по гену DHFR (легкая амплификация кассет) • Большое время создания продуцента (до 1 года) • Медленный рост ( промышленное культивирование до 200 дней) • Требует соблюдения полной стерильности и защиты от заражения вирусами • Некоторые ферментные системы пост-трансляционных модификаций имеют ограниченные возможности и требуют оверэкспрессии генов • Ограниченный пролиферативный потенциал (до 25 пассажей) • Дорогая культуральная среда

21. CHO – вариант системы экспресии • Внехромосомная репликация вектора • Индуцибельный промотор • Специальный штамм • Дополнительный остаток Met[-1] или лидерный пептид • Блок стоп-кодонов

22. Methotrexate (MTX) Selection Gene of interest DHFR Transfect dfhr- cells Grow in Nucleoside Free medium Culture a Colony of cells Grow in 0.05 uM Mtx Culture a Colony of cells

23. Methotrexate (MTX) Selection Grow in 0.25 uM Mtx Culture a Colony of cells Grow in 5.0 uM Mtx Culture a Colony of cells Foreign gene expressed in high level in CHO cells

24. CHO – примеры использования Гормоны и цитокины • Bone Morphogenic Protein-2, rDNA • Bone Morphogenic Protein-7, rDNA • EPO, rDNA/Amgen • EPO, darb-, rDNA • Corifollitropinalfa, rDNA • FSH rDNA/Schering-Plough • G-CSF, rDNA/Sanofi • Luteinizing hormone, rDNA • Interferon beta-1a, rDNA/Biogen • Insulin-like Growth Factor-1/IGFBP-3, rDNA • Thyroid stimulating hormone, rDNA • hCG, rDNA • Ферменты • Arylsulfatase B, rDNA • DNase, rDNA • Galactosidase, beta rDNA • Glucocerebrosidase, rDNA • Glucosidase, rDNA • Iduronidase, rDNA • Антитела • CD11a Mab, rDNA • CD20 Mab, rDNA • CD20 Mab, rDNA conc. • CD20 Mab, rDNA/Y-90 & In-111 radioconj. • CD52 Mab, rDNA • EGF receptor Mab, human, rDNA/Amgen • HER2 receptor Mab, rDNA • Immunoglobulin E Mab, rDNA • RANKL Mab, rDNA • TNF Receptor-IgGFc, rDNA • VEGF Mab, rDNA • CTLA4-Ig, rDNA • LFA-3/IgG1, rDNA • Система свертываемости крови • Factor IX, rDNA/Wyeth • Factor VIII, rDNA/Baxter • Factor VIII BDD, rDNA, PFM • tPA, rDNA/Genentech • tPA, TNK-, rDNA • Thrombin, rDNA

25. Иван И. Воробьев, лаборатория медицинской биотехнологии Гематологического научного центра РАМН, лаборатория биокатализа Института биоорганической химии РАН, ptichman@gmail.com Слайды можно скачать: lmbt.ru/lectures/kmb08.ppt