Reação em cadeia da Polimerase PCR

1. Reação em cadeia da Polimerase PCR A reação em cadeia da polimerase (PolymeraseChain Reaction- PCR) é a amplificação enzimática de uma seqüência específica de DNA, visando a produção de milhões de cópias desta seqüência em um tubo de ensaio. Termociclador

2. REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) Técnica que permite a amplificação da quantidade de DNA específico utilizando a enzima Taq DNA polimerase, sequências iniciadoras específicas (primers) e variações de temperatura controladas.

3. ETAPAS DO PCR Uma fita simples de DNA é usada como molde para a síntese de novas cadeias complementares sob a ação da enzima polimerase do DNA, capaz de adicionar os nucleotídeos presentes na reação, segundo a fita molde. 1. Adição de reagentes DNA dATP dCTP dGTP dTTP (nucleotideos) Taq polimerase Primers Tampão Água

4. Taq DNA polimerase O nomeTaqvem de Thermusaquaticus, queé umabactériaencontradasobrevivendo a altastemperaturasemgeisers no Yellow Stone National Park.

5. Taq DNA polimerase Termoestabilidadelimitada Temperatura T 1/2 (minuto) 92,5oC 130 95,0oC 40 97,5oC 5

7. Seqüências dos primers • A polimerase do DNA requer, entretanto, um "ponto de início" ligado à fita molde que servirá de apoio para que os nucleotídeos subseqüentes sejam adicionados. • Esse ponto de início da síntese é fornecido por um oligonucleotídeo que se hibridiza (se anela) à fita molde simples, o qual é denominado de primer. • Ambas as fitas simples iniciais servem de fita molde para a síntese, desde que se forneça primers específicos a cada uma delas. • Dessa forma, a região do DNA genômico a ser sintetizada é definida pelos primers, que se anelam especificamente às suas seqüências complementares na fita molde, delimitando o fragmento de DNA que se deseja amplificar.

8. Seqüências dos primers • Os primers (forward - sensee reverse - antisense) devem ser construídos de acordo com a conveniência do investigador, de modo que esses possuam seqüências complementares a determinadas regiões do DNA que limitam os segmentos a serem amplificados.

9. Desoxinucleotídiostrifosfatados (dNTP) • São as bases nitrogenadas que constituirão as novas cadeias de DNA. • Sua concentração numa reação pode variar de 20 a 200 uM sendo importante que as quatro devam variar em concentrações equivalentes. • Quando estão em excesso (um nucleotídeo ou todos) podem ocorrer erros de incorporação de bases, gerando cópias alteradas

10. Íon magnésio • O íon magnésio (Mg++) é um co-fator enzimático que desempenha um papel de extrema importância na atividade da enzima Taq DNA polimerase. • Sua concentração em torno de 1,5 mM é aplicável a maioria das necessidades. • - Se a concentração de Mg2+ é muito baixa, temos pouco ou nenhum produto • - Se a concentração de Mg2+ é muito elevada, a PCR tem baixa especificidade. Observa-se muitas bandas ou “smear”.

11. Smear

12. PCR “Requerimentos” • Cloreto de Magnésio: .5-2.5mM • Tampão: pH 8.3-8.8 • dNTPs: 20-200µM • Primers: 0.1-0.5µM • DNA Polimerase: 1-2.5 units • DNA Alvo:  1 µg

13. ETAPAS DO PCR 1. Adição de reagentes DNA dATP dCTP dGTP dTTP (nucleotideos) Taqpolimerase Primers Tampão Água 94ºC DENATURAÇÃO 57ºC ANELAMENTO 72ºC EXTENSÃO 2. Alternância de temperaturas (Termociclador) 25-40 (35) CICLOS http://www.roche.pt/portugal/index.cfm/produtos/equipamentos-de-diagnostico/products/molecular-diag/intro-pcr/

14. 94ºC DENATURAÇÃO O tubo de ensaio é submetido a uma alta temperatura (geralmente 94º C por 5 minutos) para provocar o rompimento das pontes de hidrogênio entre ambas as cadeias de DNA, causando a desnaturação da molécula.

15. Primer forward Primer reverse 57ºC ANELAMENTO A temperatura é rebaixada (30 a 60º C por 30 segundos) quando, então, os primers têm a oportunidade de se anelarem às suas seqüências complementares do DNA genômico. .

16. Taq DNA polimerase 72ºC EXTENSÃO Finalmente, a temperatura é colocada em torno de 72 oC (por 2 a 5 minutos), temperatura ideal para que a polimerase do DNA utilizada na reação atue, dirigindo a síntese de novas cadeias.

17. Repetindo-se esses três tipos de passos (desnaturação, anelamento e síntese), por cerca de 30 ciclos, produziremos mais de 250 milhões de cópias de uma determinada seqüência de DNA em fita dupla, uma vez que o número de cópias cresce de modo exponencial a cada ciclo.

19. Reação: DNA Enzima Taq Primer Nucleotídeos Tampão Água Análisedos dados Luz Ultravioleta Fotodocumentação Termociclador Eletroforese em gel de agarose + Brometo de Etídeo Reação de PCR + Tampão Corado (Loading Buffer)

20. Eletroforese • Técnica utilizada para separação de moléculas carregadas em um determinado meio sob influência de um campo elétrico. • A eletroforese em gel de agarose permite que as moléculas carregadas (DNA) sejam separadas em função de seus pesos moleculares (tamanho). Este gel funciona como uma barreira para o deslocamento das moléculas. • Quanto maior a molécula, maior será a resistência oferecido pelo gel, e menor será sua velocidade de deslocamento.

21. A carga das moléculas de DNA é negativa, portanto, elas serão atraídas pelo pólo positivo e repelidas pelo pólo negativo.

22. ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 2% REVELAÇÃO DO BROMETO DE ETÍDEO COM LUZ ULTRAVIOLETA

23. FOTODOCUMENTAÇÃO DO GEL DE AGAROSE 2% UTILIZANDO MARCADOR LADER 100 pb 1400 1300 600 500 400 300 200 100 Marcador de pares de base (pb)

24. Ver a animação: http://pcrfilme.vilabol.uol.com.br/