1 / 62

Enterobaktériumok , Coliformok , E. coli , és Salmonella kimutatása

Enterobaktériumok , Coliformok , E. coli , és Salmonella kimutatása. 3. gyakorlat. Indikátor mikrobák. Enterobacteriaceae család (bélbaktériumok) Coliformok Escherichia coli Salmonel lák. Enterobaktériumok. Indikátor baktériumok, jelenlétük fekáliás szennyeződésre utal.

ulric
Download Presentation

Enterobaktériumok , Coliformok , E. coli , és Salmonella kimutatása

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Enterobaktériumok, Coliformok, E. coli, és Salmonellakimutatása 3. gyakorlat

  2. Indikátor mikrobák • Enterobacteriaceae család (bélbaktériumok) • Coliformok • Escherichia coli Salmonellák

  3. Enterobaktériumok Indikátor baktériumok, jelenlétük fekáliás szennyeződésre utal. Előfordulás: emberi és állati béltraktus, felszíni vizek, talajflóra Jellemzőik:, Gr-, rövid pálcák, általában peritrich csillóval mozognak, fakultatív anaerobok oxidáz negatívak NO3→NO2-vé redukálják glükózt bontják sav (esetleg gáz) termelés mellett

  4. Enterobaktériumok kimutatása Lemezöntés:VRBG-agar, (hagyományos lemezöntés + fedőréteg 4 ml) kristályibolya-neutrálvörös-epe-glükóz, 37oC, 24 óra értékelés: 0,5 mm-nél nagyobb, ált. 2-3 mm-es, kerek, sötétvörös, csapadékkal körülvett (epesavas sók kicsapódnak, Na-dezoxikolát, Na-taurokolát) telepek Folyékony: BBG-leves: brillantzöld-glükóz-epe leves, 37oC, 24 óra értékelés: zavaros és kisárgul → VRBG agarra

  5. VRBG

  6. OXIDÁZ-próba 1%-os parafenilén-diamin-oldat negatív: sárgás pozitív: kékes Pár másodperc - perc, A vas katalizálja!(üvegbottal, műanyag kaccsal végezhető) Enterobaktériumok:negatív

  7. FERMENTÁCIÓS próba Szőlőcukros magas agar (egy telepet leszúrunk), 37 oC, 24 óra pozitív: sárga, gázt termel Enterobaktériumok: az eredetileg piros színű agar főleg az alján sárgul ki (fak. anaerob), és homogén (mert mozog a szúrási csatornából) s

  8. Szőlőcukros magasagar

  9. KATALÁZ próba 1 kacsnyi telep + pár csepp 10%-os H2O2 tárgylemezen → +: pezseg Enterobaktériumok: pozitív

  10. Coliformok Laktózt 30°C-on egyidejű sav és gáz termelés mellett bontják Escherichia (E. coli), Klebsiella (K. oxytoca), Citrobacter (C. freundii), Enterobacter (E. aerogenes) nemzetség • Gr-, vaskos pálcák, • epét vagy epesót tartalmazó táptalajban 30°C hőmérsékleten sav- és gázképződéssel bontják a laktózt, • Többnyire a normál bélflóra tagjai, de van kivétel is (pl. E. aerogenes, amely soha nem fordul elő a bélben) • Jelenlétük a friss fekáliás szennyeződést valószínűsíti

  11. Klebsiella

  12. Coliformok kimutatása VRBL táptalaj (kristályibolya-neutrálvörös-laktóz-epe) • gátlóanyag: kristályibolya, Na-dezoxikolát • savtermelés → neutrálvörös → piros, precipitációsudvar, min. 1 mm • 0,5 mm átmérőjű, sötétpiros (lilás-vörös) telepek Endo agar • gátlóanyag: Na-szulfit, fukszin • laktóz→savak, aldehidek→aldehid+fukszin-szulfit → felszabadul a fukszin → vörös telepek (E. coli esetében ez olyan intenzív, hogy a fukszin kikristályosodik → fémes zöld fukszin-fény)

  13. VRB agar

  14. Endo agar

  15. Coliformok kimutatása BBLleves (brillantzöld-laktóz-epe leves), Durham cső, 30°C, 24-48 óra, zavarosodás+1/10 gáz → Coliform gyanús Laurilszulfát-laktóz-leves gátlóanyag: Na-lauril-szulfát Durham cső, 30°C, 48 óra → 1/10 gáz X-leves (szintetikus táptalaj) ammóniumsó, laktóz, puffer, nyomelemek

  16. Kromogén Coliform agarok

  17. Escherichia coli Csak a bélcsatornában él, jelenléte mindig friss fekáliás kontaminációt jelez (index mikroba) Önmagában többnyire ártalmatlan, vagy hasznos, egyes törzsei kórokozók (pl. E.coli O157 H7) Kimutatása során el kell különíteni a Coliformoktól

  18. IMV(E)C próbák Eijkman-próba: tenyészetből 1 kacsnyit BBL-levesbe → 44,5°C 48 óráig vízfürdőben inkubáljuk → gyanús: zavaros + 1/10 gáz Durham csőben → VRBL agar → nutritív agarra szélesztjük az E. coli gyanús piros 2 mm átmérőjű telepet, és ezekkel végezzük el az IMVEC próbákat

  19. IMV(E)C próbák Indolképzési próba: TRIPTONVÍZbe oltunk, 24 óra 44,5°C inkubáció 0,5 ml KOVÁCS-reagens (p-dimetil-amino-benzaldehid amil-alkoholos sósavval savanyított oldata) 1 perc: + felszínen meggypiros gyűrű Triptofán + víz → piroszőlősav + indol → +KOVÁCS-reagens → ROZINDOL festék

  20. IMV(E)C próbák Metilvörös próba: PUFFEROLT GLÜKÓZLEVES, 24 óra 37°C inkubáció 1-2 csepp METILVÖRÖS reagens +: az egész leves színe élénkpiros –: az egész leves színe sárga A kevertsavas, és a butándioloserjesztést végző baktériumokat különíti el egymástól (E.colikevertsavas erjesztést végez)

  21. IMV(E)C próbák VP próba: PUFFEROLT GLÜKÓZLEVES, 24 óra, 37°C inkubáció 0,2 ml 5%-os alkoholos naftol-oldat 0,1 ml 40%-os KOH 2 csepp 0.5%-os kreatin-oldat 2 óra múlva +: tenyészet felső része piros A glükózt butándiolosan erjesztő baktériumok kimutatására szolgál.

  22. IMV(E)C próbák VP-próba Glükóz → acetil-metil karbinol (acetoin) [ez a butándiolos erjedés egy köztes terméke] ↓ O2, KOH diacetil ↓ +kreatin piros szín

  23. IMV(E)C próbák Citráthasznosítási próba: ALAPLEVES, 4-6 óra inkubáció, 37°C-on, majd oltótűvel CITRÁTOS magas-ferde agarba szúrunk és a felületén is szélesztünk → 24-48 óra, 37°C inkubáció→ +: eredeti zöld KÉK-re vált -: eredeti zöld szín marad, nincs baktérium-növekedés (Brómtimolkék pH=6,8-on zöld, pH=7,6-on kék)

  24. Az IMV(E)C próbák értékelése

  25. β-D-glükuronidáz pozitív Escherichia coli kimutatása β-D-glükuronidáz enzim kimutatása MUG-al MUG ( 4-metil-umbelliferil-D glükuronid): umbelliferil→ β-D-glükuronidáz → umbelliferon (fluoreszkál) β-D-glükuronidáz enzime csak az E. colinak van (néhány Salmonella és Shigella törzstől eltekintve), a fluoreszcencia így nagy valószínűséggel E. coli jelenlétére utal. (E. coli O157:H7 nem képes ilyen enzimet termelni!) E. coli MPN: laurilszulfát leves + MUG

  26. β-glükuronidáz-pozitív E. coli számának meghatározása Minta (10 g/ml) + peptonvíz (90 ml), hígítási sor TBX (tripton-epe-glükuronid) agar lemezöntés (1 ml) Inkubálás 44± 1 oC 18-24 óra Pozitív telep: kék További megerősítő vizsgálatok nem szükségesek!

  27. Salmonella • Enterobacteriaceae család • Gram -, nem spórás • Önálló mozgásra képes, peritrich csillós kivétel: S. Gallinarum, S. Pullorum, S. Typhi • 1 faj (Salmonella enterica), a szerotípusokat így írjuk: S. Enteritidis, S. Senftenberg, S. Typhimurium, S. Infantis, stb. (nagybetű, nem dőlt!!) • Fakultatív anaerob • Laktózt nem bontja, de • Salmonella subgenus III (Arizona)-ba tartozó törzsek laktóz +, ONPG + • Salmonella subgenus II-be tartozó törzsek között laktóz -, ONPG +

  28. Általános tulajdonságok Növekedés: 7-49,5°C, optimum: 35-37°C pH=3,8-9,5, optimum pH=7-7,5 Ellenálló képesség: • Fagyasztástól nem pusztul el • Alacsony vízaktivitás mellett (pl.: csokoládé: aw=0,3-0,5) sokáig (hónapokig) túlél, és megnő a hőtűrő-képessége • Az alacsony pH-t kevésbé bírja, mint az E. coli • D idők: • 60°C-on 2-6 perc • 70°C-on <1 perc • (alacsony vízaktivitáson extrém hosszú túlélés: D-idő 70°C-on 1050 perc) • 0,1% ecetsav (pH=5,1) jelenlétében a növekedése gátolt

  29. Salmonellák kimutatása A Bizottság 2073-2005/EK rendelete az élelmiszerek mikrobiológiai kritériumairól Kimutatási protokoll: MSZ EN ISO 6579 szerint Mintavétel: • 25 g (vagy egyes esetekben 10 g) minta • 100 cm2 lemosásával vagy ismert mennyiségű öblítőfolyadék Minta előkészítése: homogenizálni, majd azonnal leoltani. Szükség esetén 0-5°C-on 1 órát lehet várakozni.

  30. Tenyésztési protokoll: Elődúsítással kombinált dúsítás I. 25 g vizsgálati anyag + 225 ml előmelegített pufferolt peptonvíz ↓ H O M O G É N E Z É S ↓ 18±2 óra 37±1°C (elődúsítás) 0,1 ml 1 ml ↓ ↓ +10 ml RVS dúsító +10 ml MKTTn dúsító ↓ ↓ 24±3 óra 41,5±1°C 24±3 óra 37±1°C ↓ ↓

  31. Tenyésztési protokoll: Elődúsítással kombinált dúsítás II. ↓ ↓ ↓ ↓ XLD Másik táptalaj XLD Másik táptalaj ↓ ↓ ↓ ↓ 24±3 óra 37±1°C 24±3 óra 37±1°C Jellemző telepek kiválasztása ↓ Kioltás nem szelektív tápagarra (24±3 óra 37±1°C) Biokémiai próbák Szerológiai próbák

  32. Dúsítók RVS: Rappaport-Vassiliadis dúsító Malachitzöld, Mg-klorid, NaCl, K-dihidrogén-foszfát, pH=5,2±0,2 MKTTn: Müller-Kauffmann-tetrationát-novobiocin Na-tioszulfát, marhaepe, brillantzöld, lugol-oldat, CaCO3, novobiocin, pH=8,2±0,2 Régen használatban volt még: Bierbrauer-féle leves: Na-tioszulfát, lugol-oldat, marhaepe, CaCO3, malachitzöld, brillantzöld Szelenit-cisztin leves: Na-szelenit, laktóz

  33. Szilárd táptalajok - XLD XLD agar: Xilóz-lizin-dezoxikolát agar xilóz, laktóz, szacharóz (egyiket sem bontja!), L-lizin-hidroklorid, Na-tioszulfát, ammónium-vas(III)-citrát, Na-dezoxikolát (eredetileg vörös színű a táptalaj) • Xilóz, laktóz, szacharóz savvá bontása → sárga szín • H2S képződése → vas-szulfid → fekete szín • Lizin → kadaverin (dekarboxilálás) → telepek körül bíbor szín (pH-változás) • Na-dezoxikolát: Proteus telepek rajzásának gátlása, Gram+-okat gátolja Salmonella: telepek színe azonos a táptalaj színével (vöröses-bíbor), gyakran fekete középpel

  34. XLD

  35. Egyéb szilárd táptalajok BPL agar: Brillantzöld-fenolvörös-laktóz agar lila, apró telepek, mivel pH nő (savra sárgulna) Brillantzöld gátolja a Gram+-okat, a S. Typhi-t és a Shigellákat BPLS agar: Brillantzöld-fenolvörös-laktóz-szacharóz agar Sem a laktózt, sem a szacharózt nem bontja, így liláspiros telepeket képez. A laktóz negatív, de szacharóz pozitív zavaró flórát lehet vele kiszűrni. Drigalski agar: sötétkék telep, mert Salmonella laktózból nem termel savat, sőt fehérjebontás miatt a pH megemelkedik Rambach agar:propilénglikol bontás, telep piros (savképzés - neutrálvörös indikátor), egyes estekben színtelen: S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Typhisuis, S. Gallinarum SS agar: Salmonella-Shigella agar laktóz, marhaepe, Na-tioszulfát, Na-citrát, ammónium-vas(III)-citrát, brillantzöld, neutrálvörös Szulfidképződés → fekete közepe lesz a telepeknek Laktózt nem bontja → vörös marad a táptalaj

  36. BPLS

  37. Az MSRV agar MSRV agar: Modified Semi-solid Rappaport-Vassiliadis agar • A kimutatás a Salmonellák mozgékonyságán alapul: a Salmonella-migráció a félfolyékony tápközegben opálos udvaros növekedést eredményez. • Nagy háttérfertőzöttségű minták esetén (pl.: bélsár-minta, cloaca-tampon) a dúsítási folyamatban az RVS dúsító helyett használatos. Ilyenkor a dúsítás végén a rajzás széléről kell továbboltani.

  38. Biokémiai megerősítés TSI ferde agar: Triple-sugar-iron agar 10g laktóz, 10g szacharóz, 1g glükóz, Fe-citrát, Na-tioszulfát, fenolvörös 1. Glükóz bontás: (TSI) savképzéssel + sav és gáz + 2. Laktózbontás: - , (TSI) Salmonella enterica subsp. arizonae: + vagy – laktózbontás 3. Szacharóz bontás: - (TSI) 4. H2S termelés: +, (TSI)

  39. Biokémiai megerősítés RÖVID BIOKÉMIAI SOR 1. Glükóz bontás: + 2. Laktózbontás: általában - 3. Szacharóz bontás: - 4. H2S termelés: + 5. Karbamid bontás: - 6. Indolképzés: - 7. Lizin-dekarboxilálás: + 8. Voges-Proskauer próba: - 9. ONPG-reakció: általában -

  40. TSI agar • TSI alja sárga: glükóz pozitív • TSI teteje piros: laktóz és szacharóz negatív • Fekete foltok a TSI agarban: H2S-termelés

  41. Biokémiai próbák 5. Ureáz-próba: (Karbamid bontás) - (karbamid leves, 37°C, 24-48 óra) értékelés: karbamid bontás esetén a felszabaduló NH3 a fenolvörös indikátor színét rózsaszínre, később lilára változtatja

More Related