Regulacja kwitnienia

1. Regulacja kwitnienia

2. Rośliny kwiatowe przechodzą fazę wzrostu wegetatywnego (wytwarzanie pędów i liści) i fazę kwitnienia, w trakcie której wytwarzają organy służące do rozmnażania płciowego • U roślin jednorocznych faza wegetatywna zaczyna się w momencie kiełkowania nasion. Następująca po niej faza kwitnienia kończy się starzeniem się i śmiercią rośliny. • U roślin dwuletnich, faza wegetatywna trwa przez pierwszy rok, w drugim roku następuje kwitnienie, które kończy się śmiercią rośliny. • U roślin wieloletnich, kwitnienie następuje co rok, przez wiele lat. Wzrost wegetatywny pędu następuje w merystemie wierzchołkowym. Jest to masa niezróżnicowanych komórek na szczycie pędu. Podziały mitotyczne tych komórek wytwarzają komórki, które różnicują w części pędu, liście, wtórne merystemy (zwane też pączkami bocznymi) – dają początek rozgałęzieniom pędu.

3. Kwitnienie jest regulowane przez wiele czynników Kwitnienie wymaga przekształcenia merystemu wierzchołkowego w merystem kwiatowy Zależy to od: • Czynników wewnętrznych • Czynników zewnętrznych

4. Regulacja przez temperaturę • Wiele roślin jednorocznych (np. pszenica ozima) i dwuletnich ma opóźniony czas kwitnienia, jeśli nie przejdzie w trakcie zimy okresu zimowego przechłodzenia. Zmiany powodowane przez ten okres zimowego przechłodzenia noszą nazwę wernalizacji. • U wielu drzewiastych roślin kwiatowych rosnących w klimacie umiarkowanym (jabłonie, bzy), kwitnienie wymaga uprzedniej ekspozycji na niską temperaturę. Drzewa te nie kwitną w klimacie ciepłym, w którym nie ma wyraźnych zim. Stan uśpienia pąków jest zlokalizowany.

5. Regulacja przez fotoperiod (stosunek długości dnia do nocy) • Fotoperiod jest wykrywany w liściach (np. roślina X potrzebuje dnia o długości co najmniej 8,5 godziny, by móc zakwitnąć). Jednak wystarczy, by tylko jeden liść był eksponowany na właściwy fotoperiod, aby kwiaty pojawiały się na całej roślinie. • Liście produkują sygnał chemiczny - florigen, który jest transportowany do merystemów wierzchołkowych. • Chemiczna natura florigenu nie jest wyjaśniona, jednym z jego składników może być białko kodowane przez gen FT (Flowering locus T). Florigen może się przemieszczać poprzez system naczyniowy

6. Budowa kwiatu • Merystem kwiatowy różnicuje w cztery koncentryczne okółki (kręgi) komórek, które tworzą następnie cztery części kwiatu. • Komórki w okółku 1 rozwijają się w działki kielicha, tworzące najniższy poziom. Łącznie działki tworzą tzw. kielich. • Okółek 2 daje początek umieszczonym nad kielichem płatkom, tworzącym razem koronę kwiatu. Korona kwiatu jest jego najbardziej barwną częścią. • Okółek 3 rozwija się w pręciki, męskie organy płciowe. • Okółek 4 (najbardziej wewnętrzny) tworzy słupki, narządy płciowe żeńskie. Często zlewają się w pojedynczą strukturę. 1 2 3 4

7. Model ABC rozwoju kwiatu • Wyniki analizy genetycznej mutantów Arabidopsis i Petunii, sugerowały, że istnieje grupa genów kodujących czynniki transkrypcyjne (główne włączniki) niezbędne do włączania genów warunkujących rozwój działek kielicha, płatków korony, pręcików i słupków. • Te główne włączniki należą do trzech klas: A, B i C. • Komórki, w których wyrażane są tylko geny klasy A tworzą działki kielicha. • Komórki, w których wyrażane są zarówno geny klasy A jak i klasy B, tworzą płatki korony. • Komórki, w których wyrażane są zarówno geny klasy B jak i klasy C, tworzą pręciki. • Komórki, w których wyrażane są tylko geny klasy C tworzą słupki. Geny ABC: Grupa A: Apetala1 (AP1) Apetala2 (AP2) Grupa B: Apetala3 (AP3) Pistilata (PI) Grupa C: Agamous (AG)

8. Efekty mutacji w genach ABC

9. Geny klasy A i C są w stosunku do siebie represorami. W nieobecności A, C są aktywne w całym kwiecie. W nieobecności C, A są aktywne w całym kwiecie. Relacje między genami ABC Efekty mutacji w AP1

10. Geny klasy E (SEP) uzupełniają geny modelu ABC • Geny SEP (SEPALLATA), obok genów ABC, są niezbędne do prawidłowego określania tożsamości organów kwiatowych

11. Większość genów ABCE koduje czynniki transkrypcyjne z domeną MADS • Domena MADS występuje na N-końcu białka i warunkuje: wiązanie do DNA, zdolność do dimeryzacji i lokalizację jądrową. • (tylko białko AP2 nie należy do rodziny białek MADS) • Arabidopsis zawiera ponad 100 genów kodujących różne białka z domeną MADS. Domena K MADS Domena C

12. Niezależna ewolucja genetycznych narzędzi kontroli rozwoju u zwierząt i roślin Meyerowitz, EM. Science (2002)

13. Centralna rola genu LFY (LEAFY) • Ortologi LFY występują u wszystkich gatunków roślin (także nie kwiatowych). • Aktywność LFY jest konieczna i wystarczająca do determinacji merystemu kwiatowego. • Niezależnie od determinacji typu merystemu, LFY pełni dwie kluczowe funkcje w rozwoju kwiatu: • Jest głównym integratorem sygnałów prowadzących do indukcji kwitnienia. • Jest głównym aktywatorem genów ABCE.

14. Cztery fazy rozwoju kwiatu • W odpowiedzi na sygnały ze środowiska i sygnały wewnętrzne roślina przestawia się z wzrostu wegetatywnego na wzrost reprodukcyjny – ten proces kontrolują geny regulujące czas kwitnienia (flowering time genes). • Sygnały z różnych ścieżek wpływających na czas kwitnienia są integrowane, co prowadzi do aktywacji niewielkiej grupy genów tożsamości merystemu (meristem identity genes), które warunkują powstanie kwiatu (Geny TFL1, LFY, AP1). • Geny tożsamości merystemu aktywują geny tożsamości organów kwiatowych (Geny ABCE). • Geny tożsamości organów aktywują zależne od nich geny „budujące organy”, które determinują różne typy komórek, z których składają się poszczególne organy kwiatu.

15. Genetyczna kontrola czasu kwitnienia Geny kontrolujące czas kwitnienia działają w czterech ścieżkach indukcji: • Zależnej od fotoperiodu (rytm dobowy, długi dzień); B. Zależnej od giberelin (GA); C. Autonomicznej; D. Wernalizacyjnej

16. U Arabidopsis liczba liści w rozecie jest miarą czasu kwitnienia

17. % % A B % % C D Analiza czasu kwitnienia w Arabidopsis, efekt mutacji w genach SWI3 days leaf No C-65-75 /27 D-60-75 /34 Wt-58-67 /54 days leaf No C-24-25 /9-10 D-24-25 /11 Wt-20-21 /11 C-3-4 D-6-7 Wt-8 C-3-4 D-6-7 Wt-8 Sarnowski et al.,Plant Cell 2005 atswi3c: early flowering in SD, slightly early flowering in LDatswi3d: early flowering in SD

18. Kontrola czasu kwitnienia – fotoperiod (long day pathway) • Wiele genów indukujących kwitnienie w długim dniu koduje białka zaangażowane w percepcję światła (PHYTOCHROME A, CRYPTOCHROM2) lub składniki regulujące zegar okołodobowy (GIGANTEA, ELF3). • Geny te ostatecznie aktywują gen CO (CONSTANS) (mutany co są późnokwitnące, nadekspresja CO powoduje wczesne kwitnienie). • CO koduje białko jądrowe zawierające dwie domeny palców cynkowych. AP1 LFY

19. Kontrola czasu kwitnienia – gibereliny • Mutanty z defektem w biosyntezie giberelin (np. ga1) są bardzo późno kwitnące w krótkim dniu, ale nie w długim, co wskazuje, że szlak GA ma kluczowe znaczenie w indukcji kwitnienia w sytuacji braku sygnału indukującego długiego dnia (fotoperiodycznego) AP1 LFY

20. Kontrola czasu kwitnienia – szlak autonomiczny i szlak wernalizacyjny • Geny szlaku autonomicznego kontrolują kwitnienie niezależne od długiego dnia (Arabidopsis jest normalnie rośliną kwitnącą w długim dniu, ale po dłuższym okresie zakwita także w krótkim dniu). Kwitniecie w krótkim dniu jest indukowane przez geny szlaku autonomicznego. • Geny szlaku wernalizacyjnego są związane z indukcją kwitnienia związana z przejściem zimowego przechłodzenia. • Geny FLC, SOC1, FT i LFY pełnią funkcję integratorów sygnałów z różnych szlaków kontroli czasu kwitnienia. AP1 LFY

21. Regulacja czasu kwitnienia Przykład badań • wybór właściwego czasu • kwitnienia jest • kluczowy dla sukcesu • reprodukcyjnego roślin • ewolucja doprowadziła • do powstania wielu • ścieżek regulujących • czas kwitnienia

22. Kontrola czasu kwitnienia Czynniki zewnętrzne Czynniki wewnętrzne Ścieżka zależna od GA Wernalizacja Ścieżka Autonomiczna Fotoperiod temperatura

23. FLC(Flowering Locus C) jest centralnym regulatorem kwitnienia FLC

24. ATG TAG gen FLC Struktura genu FLC

25. mRNA genu FLCjest podwyższony w późno kwitnących ekotypach Arabidopsis

26. FLCpodlega supresji przez Ścieżkę Autonomiczną Ścieżka Autonomiczna FCA, FY FLC

27. RBD RBD FCA białko wiążące RNA Związane z obróbką 3` końca transkryptów PPLP PPLP WD WD WD WD WD WD WD FY rejon WD silnie konserwowany u wszystkich eukariontów Q WW Q

28. FY WD40 PPLP WW SWI3 FCA pA/cleavage complex RNP transcripty -FLC ? -FCA  sygnały poliadenylacji model działania kompleksu FCA & FY

29. czy FLC jest regulowany przez RNAi ? RNAi FLC

30. RNAi (RNA interference) • cechą charakterystyczną wszystkich odmian RNAi są małe 21-24nt RNA • RNAi powstało najprawdopodobniej jako mechanizm obrony przeciw wirusom, występuje u wszystkich badanych eukariontów • RNAi został wykorzystany przez komórki do utrzymywania heterochromatyny na cetromerach i obszarach zawierających wielokrotne powtórzenia • odmianą RNAi używaną przez wszystkie znane eukarionty wielokomórkowe jest RNAi z udziałem miRNA

31. modelRNAi PTGS (Post Transcriptional Gene Silencing) TGS (Transcriptional Gene Silencing) prekursor dsRNA 21-24 nt małe RNA miRNA siRNA RISC (RNA induced Silencing Complex) RITS (RNA induced Transcriptional Silencing) tworzenie heterochromatyny: metylacja DNA, metylacja histonu H3 K9 cięcie mRNA lub inhibicja translacji

32. modelRNAi PTGS (Post Transcriptional Gene Silencing) TGS (Transcriptional Gene Silencing) prekursor dsRNA 21-24 nt małe RNA RISC (RNA induced Silencing Complex) RITS (RNA induced Transcriptional Silencing) regulacja ekspresji genów (30% ludzkich genów) Integralność centromerów, kontrolowanie transpozonów, regulacja ekspresji genów?

34. czy FLC jest regulowany przez RNAi ? RNAi FLC

35. ATG TAG nowe małe RNA o sekwencji homologicznej do rejonu 3`FLC użyta sonda liście rozety liście pędu łuszczynki kwiaty siewki pęd sonda do rejonu 3`FLC 30nt 20nt EtBR

37. dcl 2 sgs2/rdr6 nrpd1a-2 nrpd1a-3 ago4-1 Col-0 dcl 3 rdr2 Ler 30nt 20nt poziom małych RNA z 3`FLCjest obniżony w mutantach ze ścieżki polIV

38. RITS RISC modelRNAi TGS PTGS Integralność centromerów, kontrolowanie transpozonów, regulacja ekspresji genów? regulacja FLC przez RNAi– pierwszym przykładem regulacji jednokopijnego genu nie związanego z transpozonami przez siRNA

39. ATG ATG TAG TAG small RNA region small RNA region orientacja sens orientacja antysens 3`koniec FLCjest związany z transkrypcją w orientacji sens i antysens Yamada et al. Science 2003

40. flc_utr5 ATG TAG rejon małych RNA mutanty T-DNA w rejonie 3`FLC flc_utr4 flc_utr3

41. Insercja w rejon 3`FLC zaburza negatywną regulację FLC ilość liści w warunkach długiego dnia poziom mRNA FLC poziom mRNA B- tubuliny Col-0 utr 3 utr 4 utr 5

42. ilość liści w krótkim dniu Col dcl2-1 dcl3-1 rdr2-1 sde4-2 sde4-3 FLCpodlega supresji przez mutanty ścieżki RNAi

43. Struktura chromatyny

44. H3 K9 diME H3 K9 diME Struktura chromatyny euchromatyna heterochromatyna

45. przeciwciała specyficzne do H3 di-meK9 amplifikacja PCR wzbogaconych fragmentów metoda ChIP(Chromatin ImmunoPrecipitation)

46. metoda ChIP Jenuwein T

47. W łuszczynkach rejon 3`FLCjest związany ze znacznikiem H3 K9 di-methyl NoAB ChIP ŁUSZCZYNKI ŁUSZCZYNKI SIEWKI SIEWKI Ta3 rejon 3`FLC

48. ATG TAG znacznik H3 K9 di-methyl jest ograniczony do rejonu 3`FLC Wzbogacenie w stosunku do kontroli Wzbogacenie zanaczonych reionóww H3 di-me K9; ChIP nad Input

49. regulacja FLC RNAi FLC

50. regulacja FLC FRI Ścieżka Autonomiczna FCA, FY Wernalizacja RNAi FLC