DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL E PRÉ-IMPLANTAÇÃO GENÉTICA II Profa. Dra. Ana Elizabete Silva

1. DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL E PRÉ-IMPLANTAÇÃO GENÉTICA II Profa. Dra. Ana Elizabete Silva

2. Como fazer um super bebê livre de câncer de mama, outros cânceres hereditários e doenças genéticas? Diagnóstico Pré-natal (DPN) e Diagnóstico Pré-Implantação (DPI) Inglaterra-2009: -família com 3 gerações de mulheres com câncer de mama hereditário (mutação BRCA1) -fertilização in vitro e DPI -11 embriões e implantação de 2 sem mutação BRCA1 • Inglaterra-2013: • -mãe portadora da mutação p53 – S. Li-Fraumeni • -filho 3 anos falecido com câncer de cérebro • ICSI e DPI:2 embriões, 1 s/mutação implantado

3. DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL • Fornece informações ao casal para que eles tomem as decisões necessárias como: • Levar à gravidez à termo • Preparar-se para um parto difícil e os cuidados especiais necessários ao recém-nascido • Tranquilizar e reduzir a ansiedade • Terminalização da gestação • ~98% casos: resultado normal

4. Abortos devido ao DPN: 2% • DPN não exclui todos os defeitos fetais possíveis  distúrbio específico. DPN  Equipe Multidisciplinar: • obstetrícia e ultra-sonografia, • genética clínica (avaliação, diagnóstico e informação), • Exames laboratoriais (citogenética, bioquímica e análise do DNA) • Aconselhamento Genético antes e após o exame (riscos e limitações, consentimento, repetições, exames adicionais)

5. DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL Filho anterior com anomalia Anomalias cromossômicas em um dos genitores Idade materna avançada INDICAÇÕES PARA O DPN Abortos espontâneos Anomalias fetais História familiar de distúrbios genéticos Risco de defeito de tubo neural Consanguinidade entre os cônjuges

6. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL Testes não- invasivos • Ultra-sonografia • Marcadores Bioquímicos: Triagem tripla do soro materno • Isolamento de células fetais da circulação materna Nenhum risco para o feto Amplamente indicados

7. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL Testes invasivos • Amniocentese • Punção de vilosidades coriônicas (CVS) • Cordocentese risco de aborto indicado na minoria das gestações

8. CASO CLÍNICO • Um casal jovem sem história familial de doenças genéticas na família procura o obstetra devido gravidez de 13 semanas. A gravidez parece estar normal, mas o médico indicou testes de diagnóstico pré-natal não invasivos para tranquilizar o casal: • ultrassom; • translucência nucal • triagem tripla do soro materno.

9. CASO CLÍNICO • O teste de triagem tripla indicou aumento de alfa-fetoproteína, sugestivo de defeito de fechamento de tubo neural (espinha bífida, mielomenigocele, anencefalia) • Posterior exame de ultrassom revelou uma massa cística na região lombar diagnosticada como espinha bífida cística; • O médico encaminhou para o geneticista • para o aconselhamento genético adequado • e recomendou o parto por cesária para evitar risco de rompimento do cisto e acompanhamento da gestação com outros exames de US para monitorar inclusive a ocorrência de hidrocefalia.

10. CASO CLÍNICO • O casal foi orientado quanto ao risco de recorrência para o próximo filho (4%); inclusive anencefalia – herança multifatorial • suplementação com ácido fólico nas próximas gestações: dois meses antes da gravidez até um mês após a concepção; • A criança nasceu bem, sem sinal de hidrocefalia. Após correção cirúrgica tem bom desenvolvimento, com controle da bexiga e intestino e já aprendeu a falar. • O casal estão planejando uma segunda gravidez!!!

11. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL TESTES NÃO-INVASIVOS

12. TÉCNICAS NÃO INVASIVAS Ultra-Sonografia Emissão de ondas sonoras  Abdome da mulher grávida  transdutor emite e recebe o som por sinais acústicos  convertidos em sinais elétricos  amplificados e visualizados em um monitor  Tecido fetal reflete as ondas em padrões conforme à densidade do tecido

13. INDICAÇÕES • Sangramentos • Distúrbios de crescimento fetal • Gestações múltiplas • Análise direta da anatomia interna e externa • Apresentação e posição • Vitalidade • Quantidade de líquido amniótico • Idade gestacional e fetal • Localização da placenta • Morfologia fetal (11a semana)

14. DISTÚRBIOS MONOGÊNICOS • Displasias esqueléticas • Doença renal policística • DISTÚRBIOS MULTIFATORIAIS • Cardiopatias congênitas • DTNs (anencefalia, espinha bífida) • fenda labial e palatina • ANOMALIAS INDICADORAS DE SÍNDROMES • Fácies anormal • Genitália anormal • Higroma cístico • Polidactilia

15. 1o trimestre 8 meses

16. DEFEITOS DE FECHAMENTO DO TUBO NEURAL VISUALIZADOS POR ULTRA-SOM Polidactilia Anencefalia

17. Onfalocele Pé torto Fenda labial

18. TRANSLUCÊNCIA NUCAL FETAL (NT) Marcador Ultrassonográfico • Medida da região entre a pele e o tecido mole que recobre a coluna cervical • Realizada entre a 10a e 14a semana • NT: acúmulo de líquido posterior ao pescoço fetal risco de cromossomopatias (S.Down, S.Noomam, Higroma cístico e cardiopatias) 2,5 - 3,9 mm: risco 3x 4 - 4,9 mm: risco 18x Acima de 5 mm: 13% aborto

19. MARCADORES BIOQUÍMICOS • Triagem Tripla no Soro Materno: • Alfa-fetoproteina (AFP):proteína fetal (saco vitelínico e fígado) • Beta-gonadotrofina coriônica (β-hCG): produzido pelos trofoblastos • Estriol (uE3): produzido pelo feto (gl. Adrenal e metabolizado pela placenta) Triagem Tripla associada com idade materna avançada FETO COM CROMOSSOMOPATIA

20. MARCADORES BIOQUÍMICOS TRIAGEM TRIPLA • Dosagem de 3 marcadores no sangue materno: AFP, uE3 (estriol não conjugado) e HCG (Gonadotrofina coriônica Humana) • 15a a 20a semana Idade materna  + AFPSM  + uE3  + HCG  Gestações com  risco de Síndrome de Down

21. CÉLULAS FETAIS ISOLADAS DO SANGUE MATERNO • Hemáceas nucleadas (comuns no feto) • Isoladas na 8a semana • Análise FISH → trissomias • PCR → distúrbios monogênicos → sexo fetal : gene SRY (Lo et al., 1998) • Nenhum risco para o feto Dificuldade: separar populações puras de células fetais

22. MÉTODOS INVASIVOS

23. AMNIOCENTESE • Serr et al (1955):determinação do sexo por exame da cromatina X (líquido amniótico) • precoce: 12a a 14a semana • Período • tradicional: 14a - 17a semana • Coleta de uma amostra do líquido amniótico (células fetais) via transabdominal com uma seringa (20 ml)  monitorada por ultrassonografia • sobrenadante: dosagem de AFP e outras doenças metabólicas • sedimento: cultura: cariótipo e/ou extração de DNA

24. Amniocentese Diagnóstico pré-natal Testes invasivos Células fetais Cultivo Testes diagnósticos Testes diagnósticos

25. Coleta de líquido amniótico guiada por ultrassom, após anestesia local ou não • Células descamadas da bexiga, • vias respiratórias, pele, boca TV GENE - Diagnóstico Pré-Natal

26. Resultado:2- 3 semanas • Riscos: • 0,2 - 0,5% de induzir aborto • 0,1% deformidade de membros • Complicaçõesaspiração de sangue materno • Imunização por Rh da mãe (Rh-) • acidentes de punção • Infecção materna • perda de líquido (raro) • diagnóstico mais tardio

27. ALFA-FETOPROTEÍNA do Líquido Amniótico • rastreamento de fetos com DTN aberto  AFP • 95% dos bebês com DTNs nascem em famílias sem história conhecida • espinha bífida e anencefalias são detectadas (99%) • Período: 15a a 18a semana • AFPSM (16-18 semanas) : maior que 2,5 • influência de outros fatores (morte fetal, gêmeos)  AFPSMS. Down ou outros defeitos cromossômicos Suplementação com ácido fólico: 1 mês antes da concepção e durante o 1º trimestre de gestação Em 75% os NTD

29. Coleta de amostras das vilosidades coriônicas (CAVC) • tecido do trofoblasto (estruturas digitiformes) da área vilosa do cório (placenta) • via transcervical ou transabdominal (monitorização ultrassonográfica) • período variável  8a - 12ª semana • Complicações: • - sangramento ou aborto (1%) • - risco de defeitos de redução de membros • - sucesso da análise cromossômica é menor • - CAVC falha  amniocentese subsequente

30. Biópsia de vilo corial -cateter acoplado a seringa com meio de cultura -aspiração de ~50mg de vilo corial -cultura de curta duração (24h) -resultado em 1-3 dias http://laboratoriogene.info/TVGENE/DXPN.htm

31. Coleta transcervical Coleta transabdominal Vantagem em relação à amniocentese: culturas de curta duração Desvantagem: -medição da AFP não pode ser realizada -mosaicismo placentário (1-2%) • INDICAÇÕES: • doenças metabólicas • extração DNA • cariótipo

32. CORDOCENTESE • amostra de sangue fetal do cordão umbilical (linfócitos) • período:a partir da 18 semana • Aplicações: • presença de alguma anormalidade fetal detectada pela ultra-sonografia • falha nas culturas de amniocentese e vilo corial • cultura de células de línfócitos – curta duração (2-3 dias) • extração de DNA • Hemoglobinopatias e doenças hematológicas

33. -Colheita de 1 – 6 ml de sangue – veia umbilical - Risco de aborto: até 3% acima da média normal -Complicação: hemorragia no sítio de punção

34. Diagnóstico pré-natal Cordocentese • Amostra direta do cordão umbilical • 18ª a 21ª semana de gestação Alguns dias... análise Cultura de células

35. Diagnóstico pré-natal Testes invasivos O que fazer com o material coletado? Cultura Cariotipagem FISH Análises no DNA Aneuploidias (13,18,21,X, Y) Análises bioquímicas

36. EXAMES LABORATORIAIS A PARTIR DE MATERIAL COLETADO • CARIÓTIPO • culturas de curta duração (48-72 horas) resultado ~2 semanas Cariótipo mostrando Síndrome do duplo Y

37. EXAMES LABORATORIAIS A PARTIR DE MATERIAL COLETADO • CITOGENÉTICA MOLECULAR - FISH • núcleos interfásicosaneuploidias (13, 18, 21, X e Y) Trissomia do 21 Normal Triplo X

38. ANÁLISE DO DNA • marcadores específicos • detecção direta da mutação • Exemplos: • Distrofia Muscular Duchenne  deleções de genes ou rearranjos • Anemia falciforme, Hemofilia A  mutações puntiformes • doença de Tay-Sachs ou Fibrose cística  mutações específicas.

39. 97- 98%

40. ABORTO SELETIVO • Quando uma anomalia fetal deve ser considerada grave a ponto de justificar a interrupção da gestação? • E as doenças de manifestação tardia e progressiva?

41. DIAGNÓSTICO GENÉTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃO

42. DIAGNÓSTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃO Selecionar embriões livres de doença genética para implantação no útero OBJETIVO Biópsia - Blastômero Pré-Concepção Remoção do 1o. ou 2o. corpúsculo polar  Não está envolvido com o desenvolvimento do embrião Remoção de um blastômero  Células totipotentes Não afeta embrião

43. DIAGNÓSTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃO • Abortos anteriores de causa desconhecida • Idade materna avançada • Rearranjos estruturais nos genitores • Mutações gênicas • Mosaicismo gonadal INDICAÇÕES

44. DIAGNÓSTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃOPré-Concepção ou Biopsia de Corpúsculo Polar • DNA do corpúsculo polar → conter mutação causadora de doença → ovócito não contém → é então fertilizado e implantado - Desvantagem: não detecta aneuploidias paternas e anomalias após a fertilização - Método caro e limitado

45. DIAGNÓSTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃOBiópsiade Blastômero • Análise genética de 1-2 blastômeros removidos por micromanipulação no estágio de 8 células (3 dias), após fertilização in vitro • DNA da célula biopsiada → amplificado por PCR e submetido a testes moleculares para verificação de várias doenças → mutações gênicas • DMD • Fibrose Cística • Talassemia beta • Doenças ligadas ao X • Doença de Tay-Sachs • Hemofilia • Doença de Huntington • Retinite pigmentosa • Síndrome de Marfan • Anemia de Fanconi • Síndrome do X frágil

46. DIAGNÓSTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃOBiópsia ANÁLISE DO DNA DA CÉLULA BIOPSIADA • FISH - mulheres > 35 anos - célula fetal fixada em lâmina - Utilização de sondas específicas - 90% de eficiência • PERSPECTIVA DNA de 1 única célula amplificado e hibridizado contra um chip de centenas de marcadores FISH: Sinais para X e Y FISH: Trissomia do 21

47. DIAGNÓSTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃOBiópsia Embriões não afetados Embriões afetados Implantados Descartados Vantagem: evitar a implantação de embrião inviável. Questão ética: Seleção da vida em fase cada vez mais precoce Em que momento se inicia a vida?

48. Blastocisto no estágio de 6 células Embrião triplóide ~50% dos embriões após FIV apresentam anomalias cromossômicas -4,9% presença de malformações congênitas -PGD aumenta a taxa de implantação (40%)

50. Sheldon Reed (1947):“concenciosamente dava respostas cuidadosas a questões genéticas indagadas por pais ansiosos” (serviço genético social) ACONSELHAMENTO GENÉTICO Atualmente: Consulta Médica - “processo pelo qual um indivíduos ou família obtém informações sobre um problema genético real ou possível”