PRACTICAS EN BIOQUIMICA Cuantificación de Proteínas

1. PRACTICAS EN BIOQUIMICA Cuantificación de Proteínas

2. METODOS COLORIMETRICOS • BIURET • LOWRY • BRADFORD • BCA • Otros métodos: ABSORBANCIA (UV)

3. Cuantificación de Proteínas por Métodos Colorimétricos • El uso de un determinado método colorimétrico depende de: • Pureza de la muestra: presencia de otras proteínas, detergentes, agentes reductores • Cantidad de proteína: límite de detección del método • Disponibilidad de equipo, costo.

4. Método de BiuretGornell AG, C. J. Bardawill, and M. M. DAVID. Determination of serum proteins by means of the biuret. reaction. J. BioZ. Chem. 177: 751-766, 1949 • Reacción de sales de Cu+2 con moléculas que contienen más de dos enlaces peptídicos en un medio alcalino; el Cu+2 es reducido a Cu+1 formando complejos color púrpura que tienen un máximo de absorción a 540 nm. El método se usa para soluciones que tienen de 0.5 a 10 mg proteína/ml o más. • Es un método poco sensible. Es útil cuando se quiere analizar grandes lotes de proteína. • Existen compuestos que interfieren con la lectura, tales como tioles y sales de amonio, que pueden removerse precipitando la proteína con un volumen igual de ácido tricloroacético al 10%, resuspendiendo el precipitado que contiene las proteínas en NaOH 1 N.

5. Método de LowryLowry, OH, NJ Rosbrough, AL Farr, and RJ Randall. J. Biol. Chem. 193: 265. 1951 • Es un método más sensible que el de Biuret pudiendo detectar muy bajas concentraciones (hasta 5 ug). • El principio de la detección es el mismo que el de Biuret.Diferencia: se utiliza un segundo reactivo: la solución de Folin– Ciocalteau (fosfomolíbdato-fosfotungstato) en un medio cúprico alcalino, el cual se le agrega para incrementar la intensidad del color. • Este incremento en la intensidad se debe a la reducción del reactivo Folin– Ciocalteau por los residuos de tirosina y triptofano presentes en las proteínas. • Producto coloreado leído en espectofotómetro a 750 nm.

6. Interferencias (Lowry) Most phenols, except nitrophenols, reduce the reagent; therefore thymol and to a lesser degree sulfosalicylic acid interfere, Glycine (0.5 per cent) decreases the color with protein by 50 per cent.

8. Método de BradfordBradford, M. M. (1976) Anal. Biochem.72, 248 • El método de Bradford de basa en que el Azul Brillante de Coomasie G-250 cambia de rojo a azul, al unirse a residuos aromáticos y arginina en las proteínas. • El complejo proteína-colorante tiene un coeficiente de extinción elevado, lo que le confiere gran sensibilidad. • Cambio de 495nm a 595 nm.

9. Coomasie Brilliant Blue G-250 (utilizado en el método de Bradford)

10. Ventajas: • Reacción rápida (aproximadamente 2-5 min) • El completo proteína-colorante se mantiene por un tiempo relativamente largo (1 hora) • Rango de detección: 1 -20 ug. Desventajas: • Algunas interferencias : detergentes (Triton X-100 y SDS) • Variación entre diferentes proteínas

12. Bicinchoninic acid (BCA) assay • Similar al método de Lowry • Formación del complejo Cu2+-proteina bajo condiciones alcalinas, seguida de la reducción de Cu2+ to Cu1+ (Cys, Trp, Tyr y enlaces peptídicos) • BCA forma un complejo azul-púrpura con el Cu1+ (formado en medio alcalino) • Lectura de absorbancia a 562 nm.

13. Ventajas del método BCA: • Mas sensible que Lowry & Biuret • No tiene tanta variación como el método de Bradford • Color estable • Menos susceptible a detergentes

14. A. Método de Biuret: Concentración de BSA Stock = 28 mg/ml. 1.- Preparar 9 tubos según la tabla a continuación:

15. 2- Agregar 1,5 ml del reactivo de Biuret y mezclar por agitación. 3- Incubar por 10 minutos a 37ºC. 4- Leer en el espectrofotómetro a 540 nm. 5- Anotar los resultados y graficar.

16. B. Método de Bradford: Concentración de BSA Stock = 0.25 mg/ml. 1.- Preparar 8 tubos eppendorf según la tabla a continuación:

17. 2- Colocar en un tubo de ensayo de vidrio 800 uL de cada mezcla. 3- Adicionar 200 uL del Reactivo de Bradford concentrado, mezclar por agitación. 4- Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos. 5- Leer en el espectrofotómetro a 595nm. 6- Anotar los resultados y graficar.

18. C. Método de Lowry: Concentración de BSA Stock = 2 mg/ml. 1.- Preparar 9 tubos eppendorf según la tabla a continuación:

19. En un frasco de vidrio color ambar preparar el Reactivo 1 mezclando las siguientes soluciones en proporción 100:1:1, respectivamente: • Solución A: Carbonato de sodio (Na2CO3) al 2% en agua destilada • Solución B: Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4 5H2O) al 1% en agua destilada • Solución C: Tartrato sodio potasio tetrahidratado al 1% en agua destilada. 2.- Colocar en un tubo de ensayo 100 uL de mezcla. 3.- Adicionar 100 uL de NaOH 2N a cada tubo e hidrolizar a 100°C por 10 minutos en un Hot Plate o Agua hirviendo. 4.- Dejar que la muestra hidrolizada enfríe a temperatura ambiente por 5 minutos 5.- Agregar 1000 uL de Reactivo 1 (Reactivo de Biuret modificado) a cada tubo, dejar reaccionar por 10 minutos a temperatura ambiente. 6.- Agregar 100 uL de Reactivo 2 (Fenol Folin-Ciocalteu), mezclar en el vortex y dejar reaccionar a temperatura ambiente por 30 minutos. 7.- Leer en el espectrofotómetro a 750 nm. 8.- Anotar los resultados y graficar

20. 1. Biuret : Todos los grupos 2. Bradford : Todos los grupos 3. Lowry: 2 grupos (iniciar con este experimento)

21. Absorción Ultravioleta de las Proteínas • Todas las proteínas absorben fuertemente debajo de 230 nm. Por ejemplo, la albúmina sérica bovina (0.1% p/v) absorbe 5.0 y 11.7 a 225 y 215, respectivamente (comparado con 0.66 a 280 nm). La absorbancia por debajo de 230 nm es debido al enlace peptídico. • Consecuentemente los valores de A 0.1% son casi los mismos para todas las proteínas. Concentraciones de proteínas en el rango de 10 a 100 ug/ml pueden determinarse de la diferencia de absorbancias a 215 y 225 nm. Se prepara una curva standard graficando A vs. proteínas. (proteína)ug/ml = 144 (Acm215 - Acm225) • La diferencia de absorbancia es usada para minimizar errores que resulten de compuestos no proteicos en solución. Altas concentraciones de ciertos buffers pueden interferir (no se puede usar 0.1 N NaOH para disolver la proteína, pero 5 mM NaOH no causa problemas).