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Elisa: quantificação de proteínas e moléculas

Elisa: quantificação de proteínas e moléculas. Elisa: quantificação de proteínas e moléculas. Sistema Duplo-Híbrido de Levedura. Sistema Híbrido-Simples: identificar proteínas que ligam ao DNA. Sistema Híbrido-Simples. Sistema Híbrido-Simples. Sistema Híbrido-Simples.

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Elisa: quantificação de proteínas e moléculas

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Presentation Transcript

  1. Elisa: quantificação de proteínas e moléculas

  2. Elisa: quantificação de proteínas e moléculas

  3. Sistema Duplo-Híbrido de Levedura

  4. Sistema Híbrido-Simples: identificar proteínas que ligam ao DNA

  5. Sistema Híbrido-Simples

  6. Sistema Híbrido-Simples

  7. Sistema Híbrido-Simples

  8. 1. Reagents interacting with DNA* (a) Alkylating agents: Dimethyl sulphate, Mitomycin C, Nitrogen and sulphur mustards (b) Intercalating agents: Acridine dyes, Actinomycins, Adriamycin, Anthracenes Benzpyrene, Ethidium bromide, Propidium diiodide (c) Intertwining agents Distamycin, Netropsin 2. Analogues of bases, Acyclovir ,Adenine /3‑1‑D‑arabinoside, Amethopterin Aminopterin, 2‑aminopurine, Aphidicolin, 8‑azaguanine, Azaserine 6‑azauracil, 2'azido‑2'‑deoxynucleosides, 5‑bromodeoxycytidine Cytosine /3‑1‑D‑arabinoside, Diazooxynorleucine, Dideoxynucleosides 5‑fluorodeoxycytidine, 5‑fluorodeoxyuridine, 5‑fluorouracil, Hydroxyurea 6‑mercaptopurine 3. Inhibitors of topoisomerases: Coumericin, Nalidixic acid, Novobiocin, Oxolinic acid 4. Inhibitors of cell division: Colcemid, Colchicine, Vinblastine , Vincristine 2nd messengers/inhibitors dibut cA/GMP: [active] 1mM, Sigma B1381 Ca ionophore: [active] 5mM, Sigma 7272 PMA: [active] 10mM, Froskolin: [active] 10mM, Protein synthesis inhibitors cycloheximide: [active] 20mM, Boe 103675 chloramphenicol: [active] 100mM, Sigma anisomycin: [active] 60mM, Sigma A9789

  9. GFP: green fluorescent protein

  10. Microscopia confocal: estudo das células vivas

  11. Actina F nas células da pele do bulbo da cebola: transformação transiente utilizando A actina fundida a proteína gfp Ela está presente nas invaginações e envolta do núcleo

  12. Invaginações e dinâmica do núcleo

  13. Reconstrução tridimensional da topologia do retículo endoplasmático Nas plantas transgênicas expressando gfp

  14. Luciferinas

  15. Luciferinas

  16. Luciferinas

  17. Luciferinas

  18. Luciferinas

  19. Planta transgênica Câmera CCD para fluorescencia::: superimposição de imagens Promotor da GA20 ox fundido ao gene da luciferina Pulverização com luciferina

  20. Luciferinas: uso simultâneo de diferentes

  21. Luciferinas: Uso

  22. Luciferinas: Uso

  23. Luciferinas: Uso

  24. Aequoporina: Estudo das alterações na Concentração de cálcio In vivo e em tempo real, Por um método não-destrutivo

  25. Frio: “manchas” de aumento de calcio em resposta a baixas temperaturas

  26. Efeito Luz vermelha:::protoplasto de folha de trigo:::Fluro-3:::tempo após adição do fluoróforo Tempo após redução do Ca2+ do meio e o citosólico e fechamento do estômato Fluoróforo indo-1 Efeito do GA e do ABA nos níveis de Ca2+ em protoplastos da camada de aleurona da cevada Fura2:::gradiente de Ca2+ citosólico:::abundância canais de calcio na extremidade Fluoróforos utilizados para medir a [Ca2+] intracelular Tipos: 1) Fuoróforos monovalentes (single-wavelenghth dyes): continuam a ter a fluorescência no mesmo comprimento de onda Fluorescência dependente da [fluoróforo]: determinação semi-quantititiva do Ca2+: Ex: fura-3 e “calcio-verde”:semi-quantitativos, precisam de luz de menor intensidade (menos dano) 2) Fuoróforos polivalentes (ratio dyes): mudam o comprimento de onda da fluorescência quanto excitados Fluorescência independente da [fluoróforo]: precisão na determinação do Ca2+: Ex: fura-2 e indo 1 (polivalentes):precisão na determinação do Ca2+: precisam maior intensidade luminosa (maior dano;experimentos mais curtos)

  27. Estudo da expressão diferencial dos genes: Confecção de Bibliotecas de Subtração

  28. Checando a eficiência da subtração

  29. Confirmando a presença de uma proteína em um compartimento citosólico

  30. Hibridização in situ: FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) Mapeamento de genes Estudo da estrutura do cromossoma Estudos citogenéticos: translocação, recombinação, etc.

  31. Efeito da liberação do ABA “enjaulado” após microinjeção em células-guarda Manipulação de cálcio Enjaulado: calcio controla a orientação de crescimento do tubo polínico (crescimento só no ápice) Manipulação de substâncias ativas “enjauladas” (caged) Nucleotídeos Queladores Mensageiros secundários Peptídeos Canais de Ca2+ que Respondem ao IP3 no estômato, pólem, etc.

  32. Formas de enjaular um peptídeo ou proteína

  33. Outros sistemas modelos opcionais à Arabidopsis

  34. Phiscomitrella

  35. Phiscomitrella

  36. Phiscomitrella

  37. Phiscomitrella GFP-talina

  38. Estudo da Estrutura de um promotor 1) Análise por deleção

  39. Estudo da Estrutura de um promotor 2) Análise por mutagênese

  40. Estudo da Estrutura de um promotor 3) Análise por transativação

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