Criterios de evaluación primera versión del informe largo

1. Criterios de evaluación primera versión del informe largo • Título:Qué se hizo (1.5 ptos.) Dónde se hizo (1.5 ptos.) • Resumen: Objetivo (1 pto.) Métodología breve (1 pto.) Resultados breves (1 pto.) Conclusión (1 pto.) • Introducción: Información consultada (2 ptos.) Citas de la información consultada (1 pto.) Hipótesis (1 pto.) Objetivo (1 pto.)

2. Criterios de evaluación primera versión del informe largo • Materiales y métodos: Que este narrado en pasado (0.5 ptos.) Que este narrado en forma de párrafo (0.5 ptos.) Dónde y cuándo se hizo el experimento (1 pto.) Que describa detalladamente cómo se hizo (3 ptos.) • Resultados: Párrafo hablando de los resultados (2 ptos.) Gráficas con título explicativo y número (1.5 ptos.) Tablas con título explicativo y número (1.5 ptos.) • Discusión: Discusión del por qué de los resultados, ayudándose de información consultada (2 ptos.) Citas de la información consultada (1 pto.) Conclusión (2 ptos.) • Introducción: Información consultada (2 ptos.) Citas de la información consultada (1 pto.) Hipótesis (1 pto.) Objetivo (1 pto.)

3. Criterios de evaluación primera versión del informe largo • Literatura citada (3 ptos) Los criterios serán los mismos para la segunda versión, pero los puntajes cambiarán porque ésta vale 20 PUNTOS. Sin embargo, tenga en cuenta, que en la primera versión fui más flexible, prácticamente sólo tuve en cuenta que estuvieran todos los componentes, pero en la segunda versión voy a revisar que se hagan todos los cambios sugeridos y que se esfuerce por mejorar, sobre todo la DISCUSIÓN. Entregue la segunda versión grapada con la primera. PONDRÉ UN REPASO PARA EL EXAMEN A MÁS TARDAR EL VIERNES 18 DE NOVIEMBRE EN EL SAC

4. Actividades próximas semanas Entrega de segunda versión del informe por parte de los estudiantes y entrega de notas parciales por parte de la instructora: • Sección 040: El lunes 21 de noviembre de 11:30 a 12:30 am. • Secciones 067 y 071: Martes 22 de noviembre de 2:00 a 4:00 pm. • Todas las secciones pueden ir a esas horas para despejar dudas del parcial (23 de noviembre). La nota final del laboratorio se entregará, el miércoles 30 de noviembre de 11:00 a 12:00 am y el jueves 1 de diciembre de 2:00 a 4:00 pm

5. Biología molecular Laboratorio 12 Marcela Bernal Múnera BIOL 3051L

6. Objetivos Analizar el ADN Conocer los principios básicos de la técnica de electroforesis y su aplicación al análisis del ADN. Describir las funciones de las enzimas de restricción.

7. Introducción • El material genético de organismos tan diferentes como las aves y las bacterias muestra algunas similitudes. • La biología molecular estudia el ADN y los genes que contiene. • La biología molecular es una herramienta para estudiar relaciones evolutivas entre los organismos. También tiene aplicaciones en la agricultura y la medicina. • El cortar el ADN con enzimas de restricción es frecuentemente el primer paso para estudiar un gen.

8. Enzimas de restricción • Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, se extraen de bacterias, donde actúan como mecanismo de defensa para degradar material genético extraño que entre en la célula. • Son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia de bases nitrogenadas que reconocen. • La mayoría de estas secuencias son palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones). “Dábale arroz a la zorra el abad”

9. Enzimas de restricción • Las enzimas a usar en este laboratorio - BamHI, HindIII y EcoRI, como todas las enzimas de restricción, toman el nombre de las bacterias que la producen: EcoRI: E = género Escherichia. co = especie coli R = cepa RV 13 I = primera endonucleasa aislada de esta cepa

10. Enzimas de restricción • Existen 3 tipos de enzimas de restricción: • 1. Tipo I y Tipo III: • Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan). • b. Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento. Las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o después de la secuencia que reconocen. • c. Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.

11. Enzimas de restricción • 2. Tipo II: • Sólo tienen actividad de restricción. • b. Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen. • c. Sólo requieren Mg++ como cofactor. • d. No necesitan ATP.

12. Corte de las enzimas de restricción • Cohesivos o pegajosos: Cortan la doble hebra de ADN de manera escalonada en dos puntos diferentes. • Abruptos: Cortan las dos hebras del ADN en la misma posición (en un sólo punto).

13. Factores que afectan la actividad de las enzimas de restricción • Pureza del ADN: Contaminantes como proteínas y altas concentraciones de sal pueden inhibir la actividad de la endonucleasa. • 2. Temperatura y pH. • 3. Tipo de molécula de ADN: Si el ADN no posee una secuencia reconocida por la enzima de restricción, esta enzima no podrá cortar el material genético. • 4. Amortiguador (buffer) adecuado: Un amortiguador o buffer provee el ambiente necesario para que la enzima trabaje en condiciones óptimas.

14. Electroforesis de DNA • Luego de que el ADN es cortado con enzimas de restricción , los fragmentos generados se analizan de varias maneras. La más común es la electroforesis. • Con esta técnica se separan macromoléculas (ej. proteínas y ácidos nucleicos) a través de un flujo de corriente eléctrico. • Los fragmentos de ADN se separan a través de la electroforesis de acuerdo a las siguientes características: El tamaño de la molécula o masa. La forma o conformación del ADN (ej. ADN súper-enrollado vs. ADN lineal). El tamaño de los poros del gel. La magnitud de la carga neta de la molécula.

15. Características de los geles comúnmente usados en electroforesis

16. Electroforesis de DNA • Cuando moléculas cargadas son colocadas en un campo eléctrico, éstas migran hacia el polo positivo (ánodo) o polo negativo (cátodo) de acuerdo a su carga. • La carga neta del ADN es negativa (por la presencia de los grupos fosfatos), lo que hace que migre del cátodo al ánodo.

17. Electroforesis de DNA • Los fragmentos de DNA migrarán a una razón inversamente proporcional al logaritmo de su tamaño o peso molecular. • A mayor tamaño menor será la migración del fragmento y a menor tamaño mayor será la migración del fragmento. •   El movimiento de los fragmentos de DNA va a producir un patrón de bandas, donde cada banda corresponde a un fragmento de un tamaño particular. • El tamaño de cada fragmento puede ser determinado utilizando un marcador o una escalera de DNA cuyos fragmentos tienen pesos moleculares conocidos. • Este marcador sirve de control y migrará paralelo a las bandas de DNA que deseamos analizar.

18. Electroforesis de DNA • Los fragmentos de DNA que han sido separados por electroforesis se pueden analizar posteriormente con otras técnicas, comparar diferentes organismos o ser insertados en genomas de otros organismos para crear un ADN recombinante. Este es el principio utilizado para crear organismos transgénicos y la manipulación genética que ha producido gran impacto en la medicina y en la agricultura

19. Ejercicio 1. Práctica de uso de micropipetas • Escoge un plato Petri ya preparado con gel solidificado; este gel ya debería tener unas fosas. • 2. Escoge una micropipeta y apoye el brazo que esté agarrando la micropipeta en una superficie firme. • 3. Utilice la mano contraria para apoyar la micropipeta. • 4. Con su micropipeta, obtenga un poco de la mezcla (de agua, glicerina y tinte azul). • 5. Introduzca la punta de la micropipeta dentro de la fosa, sin tocar el gel.

20. Ejercicio 1. Práctica de uso de micropipetas 6. Vierta el contenido en la fosa, presionando el botón de la pipeta hasta el primer punto de resistencia. 7. Practique este procedimiento varias veces.

21. Ejercicio 2. Preparación de las digestiones de ADN • 1. Para preparar el ADN: • Añada 100 µL de agua destilada a un microtubo con ADN y deje a temperatura ambiente por 5 minutos. • b.) Agítelo y manténgalo en hielo o en una nevera mientras se usa. • Para preparar las digestiones: • Rotule 4 microtubos de 1-4: El 1 tiene ADN con enzima de restricción EcoRI, • El 2 tiene ADN con enzima de restricción BamHI, el 3 tiene ADN con enzima de restricción HindIII y el 4 tiene ADN sin cortar (sin enzima de restricción) • b) A cada microtubo, añada agua destilada, el amortiguador y el ADN (en esta secuencia) con las cantidades señaladas en la siguiente tabla.

22. Ejercicio 2. Preparación de las digestiones de ADN * En la mayoría de los casos, la enzima de restricción viene preparada con el amortiguador (buffer) que le corresponde.

23. Ejercicio 2. Preparación de las digestiones de ADN c) Añada cada enzima de restricción (vea Tabla) a su respectivo microtubo (excepto al microtubo número 4, ya que éste no lleva enzima) y agite los ingredientes para cada tubo con la punta de su respectiva micropipeta. Nota: El volumen total para cada microtubo es 10 µL. d) Incube cada mezcla a 37º C por una hora.

24. Ejercicio 3.1. Preparación del gel para la electroforesis. • Prepare su bandeja de electroforesis primero y luego el gel de agarosa. • 2. Suba las tapas de los lados de la bandeja para tapar esa sección y evitar que se pierda el gel. • 3. Coloque la peinilla en la bandeja de electroforesis. La bandeja tiene unas “guías” que indican donde colocar la peinilla. De no ser así, coloque la peinilla a 1 cm del borde.

25. Ejercicio 3.1. Preparación del gel para la electroforesis. • Mezcle 1 g de agarosa con 100 mL de TBE 1X en un frasco Erlenmeyer limpio y caliéntelo en una hornilla (hotplate). • Use guantes resistentes al calor

26. Ejercicio 3.1. Preparación del gel para la electroforesis. • 5. Agite girando la mezcla de vez en cuando. Cuando empiece a burbujear, y aclare, agite constantemente hasta que hierva y se vean burbujas en la superficie. • Asegúrese que toda la agarosa se ha disuelto. • Remueva de la hornilla y deje enfriar hasta que lo pueda agarrar sin quemarse. • Vierta la mezcla en la bandeja de electroforesis empezando en una esquina y rompa las burbujas con una aguja de disección. • 9. Deje que se solidifique el gel y coloque la bandeja en un lugar seguro para que no se contamine.

27. Ejercicio 3.1. Preparación del gel para la electroforesis.

28. Ejercicio 3.2. Corrida del gel para la electroforesis. • A cada microtubo incubado (del Ejercicio b), añada 2 µL de tinte (loading dye). El volumen total de cada uno es ahora 12 µL. • Nota: El tinte (loading dye) que se utiliza contiene bromofenol azul y glicerol. El bromofenol azul es un tinte que se usa para observar en la corrida por donde va el ADN, y el glicerol le da peso a la muestra evitando así que ésta se salga de la fosa. • 2. Con el gel ya solidificado, ponga la bandeja en la cámara de manera que las fosas queden en el lado negativo (cátodo). Esto asegura que las muestras migren del cátodo (atrae cargas – ) hacia el ánodo (atrae cargas +).

29. Ejercicio 3.2. Corrida del gel para la electroforesis. 3.Añada suficiente TBE 1X hasta que se cubra el gel. 4. Espere un minuto en lo que el amortiguador entra a las fosas y luego remueva con cuidado la peinilla del gel. Nota: Aunque el número de fosas creadas por la peinilla puede variar, para este ejercicio, se utilizará solamente las primeras cinco fosas. 5. Utilizando una micropipeta, cuidadosamente coloque 12 µL del tinte (loading dye) en la primera fosa. Para las demás muestras, coloque 12 µL en las fosas correspondientes según la siguiente figura. Recuerde que para cada solución o muestra, utilice una punta diferente para evitar contaminación.

30. Ejercicio 3.2. Corrida del gel para la electroforesis. 6.Coloque la tapa sin mover la cámara (el tanque) de electroforesis. 7.Se sugiere colocar un papel oscuro debajo de la cámara antes de servir las muestras. Esto le ayudará a percatarse por dónde están migrando las bandas. 8. Para correr el gel: a.) Conecte la cámara a una fuente de energía (power supply) y encienda el aparato a una razón de 10V por cada cm del gel (se correrá a aproximadamente 80 voltios).

31. Ejercicio 3.2. Corrida del gel para la electroforesis. • b) Asegúrese que el aparato esté leyendo en voltímetros y NO en miliamperios. • Verifique que vea burbujas formándose en el amortiguador, y que NO se esté calentando. • d) Verifique el voltaje para que no suba y ajuste de ser necesario. • e) Deje migrar las muestras hasta que la línea del tinte se encuentre a aproximadamente un centímetro y medio del extremo positivo. • f) Apague el equipo. • Luego de que termina la electroforesis, el ADN se tiñe para revelar los patrones de bandas formados en el gel que corresponden a fragmentos de diferentes tamaños

32. Ejercicio 3.2. Corrida del gel para la electroforesis. • 9. Para teñir el gel. • Saque su gel y colóquelo en la bandeja de tinción. • Cubra el gel con tinte (loading dye). • Deje por media hora, y agite de vez en cuando. • d.) Saque el gel usando guantes desechables (para no teñir sus manos) y colóquelo en agua para lavar hasta que destiña bastante. NO BOTE EL TINTE. El mismo se reusará. • Saque el gel y colóquelo en el iluminador. • Observe su gel y prepare un diagrama de lo que se observa, señalando las distintas bandas. • g) Descarte el gel en el recipiente correspondiente.

33. Ejercicio 3.2. Corrida del gel para la electroforesis. b) Colocando el gel en el iluminador. a) Cubriendo el gel con tinte. c) Ejemplo de un gel iluminado.

34. A: marcador con pedazos de tamaño conocidos. B: Lamda cortado con Eco R1. C: Lamda sin cortar. Ejemplo de una electroforesis Resultados luego de teñir:

35. Dibuje sus resultados • ¿Cuántos cortes o fragmentos fueron producidos por cada enzima de restricción? • Compare sus resultados con información que encuentra en la Internet. Por ejemplo, ¿cuántos fragmentos normalmente se producen por cada enzima de restricción?