Transferencia de masa

1. Transferencia de masa En un proceso de bioreacción, los sustratos son consumidos y los productos son formados por acción de un microorganismo, ó partes catalíticas de un organismo, por ejemplo enzimas. Los sustratos típicos para una célula viviente son la fuente de carbono como son los azúcares y el aceite, fuentes de nitrógeno como amoníaco y aa, aceptores de electrones como el O2. Los productos pueden ser toda clase de compuestos orgánicos, biomasa y CO2 . Para una velocidad óptima de reacción, el microorganismo, el investigador académico ó el proceso industrial de ingeniería deben ser tal que la transferencia de sustratos a la enzima ó superficie celular (ó el sitio de reacción dentro de la célula), y la remoción de P hacia afuera de la enzima u organismo sea lo más rápida posible, y preferiblemente que no haya etapas limitantes en la velocidad de la reacción. Esta transferencia involucra una serie de etapas. La etapa más lenta es la que determinará la velocidad de transferencia de masa total, y su valor debe ser comparado con la etapa de reacción cinética más lenta, para ver si la transferencia de masa afectará el comportamiento del proceso total o no. Enfocaremos reacciones que involucran células enteras. En biotransformaciones enzimáticas, las células están ausentes y el Nº de etapas de transferencia de masa disminuído, pero se pueden aplicar los mismos conceptos.

3. Cadena de etapas de transferencia de masa para un sustrato ó nutriente desde una burbuja de gas, gotas de líquido, ó partículas sólidas hacia el sitio de reacción dentro de la célula. • Etapas en la transferencia de masa • 1- Transferencia (principalmente por difusión) de sustratos desde la fase gaseosa, fase líquida ó sólida a la interfase líquida acuosa. • 2- Transporte (por una combinación de difusión y convección) a través de una película delgada de fase acuosa que rodea a la burbuja de gas, gotas de líquido, ó partículas sólidas. • 3- Transporte (por convección ó turbulencia) a través de la fase líquida a una capa delgada que rodea al microorganismo ó a partículas (aglomerados, pellet, carrier de inmovilización) que contiene a un grupo de organismos. • 4- Transporte (difusivo) a través de esta capa a la superficie celular. • 5- Transporte (pasivo por difusión y / o activo con transporte de enzimas), por fuera de la membrana celular a un sitio dentro de la célula donde la reacción tiene lugar. • Los productos formados hacen el camino inverso.

4. Fermentadores con y sin agitación mecánica: modos de contacto gas - líquido

6. Reactores mecánicamente agitados

8. Efectos de las limitaciones de la transferencia • Si una etapa de transferencia de masa es más lenta que la etapa de reacción cinética clave, esto limitará la formación de un P deseado a partir de un dado sustrato. • Como resultado, se pueden observar dos efectos tanto con células libremente suspendidas ó con organismos inmovilizados dentro de agregados de células ó partículas sólidas. • La velocidad de reacción total es menor que la máxima teórica, y el output del proceso es menor que el deseado. Ej: en la formación de ácido glucónico a partir de glucosa por una bacteria aeróbica gluconobacter oxidans. • La velocidad total de la reacción está determinada por la velocidad a la cual el oxígeno es transferido a la fase líquida. • Otro Ej es el suministro limitado de azúcar a células inmovilizadas debido a la poca difusión dentro de un carrier de inmovilización. • La velocidad total de producción es a menudo reducida reversiblemente. • Hay Ej de sistemas donde la capacidad biosintética de una célula se daña irreversiblemente después de exponerse a una limitación de transferencia de oxígeno (fermentación de penicilina). • La selectividad de la reacción es alterada. Por Ej el oxígeno sirve como un aceptor de electrones en la formación de las levaduras de panadería a partir de glucosa.

9. En ausencia de oxígeno los electrones se dirigen al piruvato resultando la formación de etanol y CO2 , en vez de producir más levaduras. Otro Ej son los cultivos de Bacillus subtilis para la producción de acetoína y 2,3 butanodiol. La relación de estos dos productos depende de la [O2] disuelto, y de la relación entre velocidades de transferencia y consumo de O2 .De nuevo el daño puede ser reversible ó irreversible. Transferencia entre fases La transferencia de oxígeno a partir de una burbuja de aire al microorganismo en un bioproceso aeróbico es una etapa de transporte relativamente lenta. El oxígeno y otros gases solubles que se dispersan en soluciones acuosas ( como hidrocarbonos hasta 4 átomos de carbono), pueden depleted caer rápidamente cuando son consumidos. Si no se los reemplaza a la misma velocidad alta la situación será nefasta para el microorganismo. La transferencia de material líquido - líquido ó líquido – sólido es comparable con la transferencia de masa gas líquido. Un Ej. Es el crecimiento sobre hidrocarbonos superiores (> 6 átomos de C). La fase aceitosa está presente en la forma de pequeñas gotas y la resistencia a la transferencia de masa está a un lado de la capa acuosa limitante. También el intercambio de material entre una fase sólida (partículas de sustrato, partículas que contienen microorganismos) y la fase líquida obedece a principios similares.

10. Transferencia dentro de una única fase Dentro de una burbuja de gas ó gotas de aceite hay el movimiento suficiente para garantizar una transferencia rápida de moléculas a la interfase con la fase acuosa, tal que la resistencia está del lado acuoso de la interfase. Si la distancia en toda la fase líquida es muy larga, puede ocurrir una resistencia de transporte. Esta situación se da en biorreactores largos donde el líquido se mezcla de una forma sub óptima. En la industria es importante tener en cuenta esta limitación sobre el sistema de reacción microbiana. Las limitaciones de transferencia de masa dentro de una fase sólida puede ocurrir con partículas de biocatalizadores que contiene microorganismos inmovilizados, ya sea como un bio film superficial unido a un carrier, ó dispersadas a través del material del carrier. El microorganismo usualmente filamentoso puede estar como aglomerado ó pellet. Un sustrato que entra a la partícula ó pellet puede consumirse tan rápido que nada entra al interior de la partícula, por lo tanto la eficiencia del catalizador es casi máxima. Además la reacción puede declinar debido a un producto inhibitorio ó tóxico, por lo tanto no se puede mover lo suficientemente rápido.

11. Transferencia a través de la membrana celular El microorganismo por si mismo puede considerarse como una fase separada (sólida ó líquida). El transporte a través de la envoltura celular (pared y membrana) ouede ser limitado, dependiendo del tamaño y propiedades físicas (hidrofobicidad, carga eléctrica) de la molécula y si el organismo está equipado con un mecanismo de transporte específico ó no. Se distinguen tres mecanismos: Difusión libre: transporte pasivo regido por una gradiente de concentración. Difusión facilitada: usa una proteína carrier. Transporte activo: el transporte se hace también con una proteína carrier con el aporte de energía libre.

12. El diámetro de las células microbianas es muy pequeño (1 a 5 micras) tal que la difusión dentro de la célula es más rápida que el transporte a través de la envoltura celular. Además en células eucariotas hay orgánulos intracelulares (vacuolas, mitocondrias) que pueden representar otra barrera al transporte. Sin embargo en términos cuantitativos este tipo de transporte es mucho más rápido que la velocidad de consumo dentro de la célula, y normalmente no limita la velocidad total en la cadena de etapas del transporte. Ecuaciones de transferencia de masa La ecuación de Fick establece que la transferencia de masa, J, de un componente en una sola fase será proporcional al gradiente de concentración en la dirección del transporte. J = -D dC / dx Cuando se considera la transferencia de masa en una fase sólida, D es la difusividad efectiva, una función del coeficiente de difusión, la porosidad del sólido y la forma de los canales dentro del sólido. Para la geometría de una hoja plana de una capa limitante con espesor d en un fluído estacionario, la relación entre el flujo de masa y la diferencia de concentración, sería: J= D ∆C /d D / d es el coeficiente de transferencia de masa, y la inversa d / D se interpreta como la resistencia contra el transporte.

13. ∆C es la fuerza impulsora para la transferencia. Para una situación de estado no estacionario, la solución de un balance de masa para una de diámetro dx resulta: D δ2C / δ x2 = δ C / δ t D: coeficiente de difusión ó difusividad efectiva (m2 / seg) C: concentración en la fase líquida (mol / m 3 ) x: distancia (m) t: tiempo (seg) Estas ecuaciones se pueden usar para calcular la transferencia de masa para un proceso por difusión. Como pre requisito se pide que el transporte convectivo esté ausente, pero esto es muy raro. Lo usual es encontrar una combinación de difusión y convección con la fase de transferencia. Como problema adicional tenemos que el patrón de velocidad del flujo líquido no es conocido. Así para una transferencia de masa gas – líquido y líquido – partícula en reactores reales se prefiere una aproximación más empírica. Transferencia de masa entre fases líquido – gas ó líquido sólida Se aplica la teoría de las dos películas que dice que el flujo de masa en ambas fases debe describirse en forma separada, mientras que la transferencia total se determina por dos pasos en serie a través de la película, según la figura siguiente:

14. El flujo de masa de la transferencia gas – líquido está descripto por: Jg =kg (p- p¡) Transporte en la película gaseosa Jl = kl (Ci - C) Transporte en la películalíquida Jg : flujo de masa molar a través de la película gaseosa (mol / m2 seg) kg : coeficiente de transferencia de masa en la película líquida (m / seg) p: presión (bar Nt / m2 ) pi :presión del lado de la interfase gaseosa Jl : flujo de masa molar a través de la pélícula líquida (mol / m2 seg) kl : coeficiente de transferencia de masa de la pélícula líquida (m / seg) Ci :concentración de la interfase del lado líquido (mol / m3 ) C: concentración en la fase líquida Las concentraciones a ambos lados de la interfase pi y Ci no son idénticas, pero ambas están relacionadas por el coeficiente de Henry, H: p¡=HC¡ En la práctica no es posible medir los valores interfaciales, por lo tanto se trabaja con un flujo de masa como una función de las concentraciones en ambas fases: ]=K (C * - C)

15. H: coeficiente de Henry (bar m3 / mol) K: coeficiente de transferencia de masa total (m / seg) C *: concentración de saturación en el equilibrio en la fase líquida (mol / m3 ) C: concentración en la fase líquida (mol / m3 ) Donde: C * = p / H es el valor de saturación en la fase líquida. (C * - C): fuerza impulsora total K: coeficiente de transferencia de masa totalque resulta de la suma de las resistencias de la transferencia. 1/ K = 1 / (H kg) + 1/ kl Esta ecuación general puede simplificarse como: 1 / (H kg) «1 / k¡(la resistencia de la película de la fase gaseosa es despreciable comparada a la resistencia de la película líquida). Usualmente la transferencia de masa se expresa por unidad de volumen del reactor, más que por unidad de área interfacial por que no es fácil de determinar. La velocidad de transferencia de masavolumétrica se expresa por: ] a = kla (C* - C) (2) a: área interfacial gas – líquido por unidad de volumen (1 / m) ó área por unidad gas – sólido más el volumen de líquido ó área por unidad gross del volumen del tanque.

16. Kla: coeficiente volumétrico de transferencia de masa (1 / seg). Cuando consideramos la transferencia de oxígeno del gas al líquido, el producto Ja se llama OTR, ó velocidad de transferencia de oxígeno. Para estimar un valor de Kla seguro se deben hacer suposiciones sobre C* (ó p) y C. Para un reactor en escala laboratorio:(< 10 l de volumen operativo) • La fase líquida se supone que está bien mezclada por lo tanto C es cte en todo el líquido. Sin embargo en planta piloto ó en una escala > (> 100 l) no sucede lo mismo, hay variaciones de concentración que se deben tener en cuenta. • Suposiciones para la fase gaseosa: • p = pin constante, hay poca ó no existe depletion de la entrada de gas. Es verdadero para reactores pequeños con un flujo de gas alto y relativamente poca transferencia. • pin :presión del gas a la entrada (bar) • 2. p = pout constante, la fase gaseosa está perfectamente mezclada. Se aplica a sistemas pequeños, pero la velocidad de transferencia es alta comparado al flujo de la fase gaseosa.

17. pout : presión del gas a la salida (bar) 3. p varía dentro del reactor, para reactores pequeños la p se expresa por su valor promedio logarítmico. En reactores grandes con un mezclado adecuado la presión hidrostática determina p, y en tanques grandes con mezclado pobre se deben usar modelos complejos. El valor de H y C* son una función de la composición del líquido y la temperatura (los gases son en general menos solubles a T altas). La ley de Henry implica que C* depende linealmente con la p.

18. Transferencia de masa gas – líquido en sistemas reales Como es experimentalmente difícil determinar los valores de kl y a por separado, se usa kla como un solo parámetro. Diferenciamos los dos tipos dominantes de reactores que se pueden usar: Columna de burbujas – air lift reactors y reactores tanque agitados. En cada caso las propiedades del líquido influyen en la magnitud de la transferencia de masa. Ej: Un líquido con gran coalescencia de burbujas. La transferencia de masa es lo más pobre. Un líquido sin coalescencia da la mayor velocidad de transferencia de masa. Columna de burbujas: elgas entra por unos orificios del distribuidor. Si el caldo es coalescente y no viscoso, las burbujas tomarán rápidamentesu diámetro promedio de equilibrio de 6 mm.

19. Cuando la velocidad del flujo de aire es lo suficientemente alta el tanque es operado en un flujo de régimen heterogéneo y el hold – up es una función de la velocidad superficial del gas (flujo de gas por unidad de área de la sección transversal del tanque), corregida por diferencias de presión (p0 es la presión de referencia de 1 bar): ε = 0.6 (vg po / p) 0.7(1) Vg : velocidad superficial de gas (m / seg) p0 : presión de referencia (bar) p: presión (bar) Se ha verificado experimentalmente para el coeficiente de transferencia de masa, la siguiente relación: kla = 0.32 (Vg pO / p) 0.7 En líquidos no coalescentes, ej: soluciones iónicas y algunos caldos de fermentación, las burbujas que se originan por el distribuidor suben pero no se mezclan con otras burbujas, por lo que el tamaño es < que 6 mm. El área interfacial, y por lo tanto el kla será > cuando las burbujas más grandes estén presentes. Si las burbujas son más grandes ellas se dispersan y toman el mismo valor de equilibrio como en líquidos coalescentes. En este tipo de reactores con un volumen > 50 m3 las burbujas se expanden lo suficiente como para subir a través del reactor debido a la disminución de la presión hidrostática. Esto influye en la transferencia de masa.

20. Reactor air – lift: la distribución de burbujas resulta en un flujo del líquido hacia arriba, en la sección de arriba las burbujas escapan del líquido, y una sección de abajo donde el líquido es recirculado downward. Aunque se parece a una columna de burbujas, el hold – up del gas es es < que lo que predice la ec (1) debido a la interacción con el flujo del líquido. Por consiguiente kla será menor respecto a la columna de burbujas. Reactor tanque agitado: el flujo está determinado por el balance: entre fuerzas de aireación y agitación. El gas distribuido se recoge rápidamente en las cavidades del gas, próximas a las paletas que giran del agitador. El flujo en éstas cavidades es de una turbulencia muy alta, y el gas es dispersado como pequeñas burbujas. Esto sigue en el flujo del líquido, pero también sube a la superficie. Ellas coalescen en áreas que son relativamente calmas y se redispersan en lugares donde la fuerza de corte es alta. Una parte de las burbujas es recirculada dentro de las cavidades y el resto escapa a la superficie. Hay una correlación disponible para el hold – up gas en líquidos coalescentes: ε = 0.13 (Pg / Vl) 0.33 (vg po / p) 0.67 ε:hold up Pg: potencia cuando pasa aire Vl: volumen de líquido (m3) Para líquidos no coalescentes el valor del hold – up es considerablemente >. Las correlaciones de kla son todas empíricas, Ps/ Vl entre 0.5 y 10 kW m3.

21. Líquidos coalescentes: kla = 0.026 (Pg / Vl) 0.4 (vg po / p) 0.5 Líquidos no coalescentes: kla = 0.002 (Pg / Vl)0.7 (vg po / p) 0.2 En líquidos coalescentes la influencia de la aireación es más grande que la agitación, mientras que para líquidos no coalescentes ocurre lo opuesto. (Las correlaciones son independientes del tipo del agitador). La cantidad de potencia entregada por el agitador de diámetro D con una velocidad de rotación N (1 / seg)se expresa como: P=PO ρl N3 D5 P: potencia de entrada (W) P0: Nº de potencia del agitador ρl : densidad de la fase líquida (kg /m3) El Nº de potencia es una función de la velocidad de aireación. El Nº de Reynolds (ρlN D2 /μ ) y el tipo de agitador según la figura:

22. Cuando un caldo es aireado, P0 generalmente cae debido al tamaño en crecimiento de las cavidades dentro de las paletas del agitador. Algunos Nº de potencia de agitadores no aireados son una función del Nº de Re. En flujo turbulento (Re > 4000) en ausencia de aireación el valor de Nº de potencia para un agitador tipo turbina de 6 hojas es constante e igual a 5. En régimen laminar (Re < 1000) hay una proporcionalidad inversa con el Re, Ej para el agitador Rushton (P0 64 / Re) Cuando se usan concentraciones altas de organismos filamentosos, los filamentos ramificados del micelio interactúan entre ellos y forman agregados que disminuyen el flujo libre del líquido. Esto resulta en una viscosidad alta y un comportamiento pseudoplástico ó elástico. Observaciones similares se han hecho cuando un microorganismo excreta sustancias poliméricas, como el xantano. La disminución de la transferencia de masa se debe en parte a la estimulación de la coalescencia de las burbujas, para formar burbujas grandes en el caldo. El Hold up es menor, por lo tanto el área interfacial será pequeña. En reactores grandes bajo condiciones extremas, se pueden observar burbujas de 1 m de diámetro. Algunas veces este efecto se compensa parcialmente por la presencia simultánea de un gran Nº de pequeñas burbujas (diámetro < 1 mm)

23. que tienen un tiempo de residencia largo en el caldo (15 min ó más). Hay también un efecto de viscosidad sobre kl. Esto se debe a la disminución de la velocidad del líquido, y no a una consecuencia directa de la viscosidad por si misma. En caldos aireados la potencia de entrada puede disminuir por el tamaño de las cavidades a medida que las paletas del agitador sean más grandes. Esto disminuirá las velocidades de corte y la ruptura de las burbujas. Para tanques agitados y medios no coalescentes: kla = 0.002 (Ps / Vl) 0.7 (vg p0 / p) 0.2 (μ / μ 0) – 0.7 Puesto que μ = μ0donde μ0 = 0.05 Pa s. Ps:potencia de entrada del agitador (W) μ:viscosidad dinámica (kg / m seg) μ0: viscosidad dinámica de referencia (kg / m seg) Si el caldo tiene un comportamiento pseudoplástico (la viscosidad disminuye con la velocidad de corte alta) ó fluído dilatante ( la viscosidad aumenta con velocidades de corte altas), se puede tomar una viscosidad promedio en el reactor: μ = K γ n - 1 γ : velocidad de corte promedio (1 / seg)

24. Que se puede estimar como: γ =10 N K: índice de consistencia n: índice de ley de potencia Los parámetros K y en el modelo reológico dependen de la concentración de la biomasa. Típicamente K es proporcional a Cαxcon el valor de α entre 1.5 y 4. Para caldos pseudoplásticos n < 1, para líquidos dilatantes n > 1, y para medios Newtonianos n = 1. Transferencia de masa líquido - sólido La descripción de la transferencia de masa a través de una película líquida ó desde la superficie de un sólido es mucho más simple que para la transferencia gas – líquido. kl es dependiente de las propiedades sólido – líquido, y el valor del área interfacial puede ser determinado experimentalmente. Usualmente la transferencia sólido – líquido se aplica a situaciones donde la transferencia de masa y la reacción están interactuando: un sustrato es transportado a través de la película líquida a la superficie de una partícula donde los microorganismos están presentes para consumir el sustrato. Los productos formados son transportados a través de la película al volumen total del líquido. Estas situaciones se tratan a menudo en términos de cinética aparente, Ej: la velocidad de reacción observada se describe con expresiones cinéticas standard, se introduce un factor de efectividad(entre 0 y 1) para describir el comportamiento de la reacción comparado a la misma reacción sin limitaciones de transporte.

25. Transferencia de masa dentro de una partícula sólida Cuando hay microorganismos activos dentro de una partícula ó agregado celular, el transporte (por difusión) dentro de las partículas puede presentar otra resistencia. Esta situación se encuentra en procesos biocatalíticos con células inmovilizadas en alginato ó partículas sólidas porosas. Una descripción apropiada del fenómeno es difícil debido a que la cinética de las reacciones microbianas dentro de la partícula pueden diferir grandemente de aquellas con células suspendidas libremente, y por lo tanto desconocido. Esto es debido a condiciones fisiológicas alteradas para las células. Además de un factor de efectividad para la transferencia de masa externa, aparece un factor de efectividad total que incluye también la resistencia intrapartícula. Determinación del coeficiente volumétrico de transferencia de masa Para estimar el valor de kla en los bioreactores se diseñan una serie de experimentos. Se usan modelos fluídos, tales como agua ó soluciones salinas, si es necesario con pulpa de papel ó polímeros agregados para imitar un caldo viscoso, y ver que se puede esperar en sistemas reales. Hay diversos métodos:

26. Método de la reacción química: Trata de imitar una reacción microbiana, el componente transferido puede ser consumido ó producido en una reacción química. Para estudios de transferencia de oxígeno, se puede usar el sulfito, que se oxida rápidamente a sulfato en la presencia de oxígeno y un catalizador. Kla se determina según midiendo la velocidad de consumo del sulfito. J a = kla (C* - C) (2) J: flujo de masa molar (mol / m2 seg) a: área interfacial por unidad de volumen de líquido (1/m) El producto J a = dCsulfito / dt , y C* = p / H para el oxígeno. Para obtener resultados seguros , se debe imponer la condición de que C es 0. Como alternativa para el sulfito se puede usar glucosa en combinación con la glucosa oxidasa (el oxígeno es consumido), ó una mezcla de agua oxigenada y catalasa ( el oxígeno es producido). También se pueden usar soluciones de Na(OH) para estudiar la transferencia de dióxido de carbono (el dióxido de carbono reacciona rápidamente con OH -.

27. Método del reemplazo físico: Consideramos un gas que es distribuido en estado estacionario, tal que C* es igual a C. El experimento comienza cuando la fracción molar de oxígeno en la fase gaseosa se cambia rápidamente del estado estacionario a otro valor. Por Ej. El nitrógeno gaseoso dispersado en un líquido es reemplazado por aire. El término J a es igual a dC /dt y por medidas continuas de la [O2] en el líquido, se puede evaluar kla de la ecuación (2). Otra posibilidad es un cambio súbito en la presión del componente a ser transferido. Este método es muy rápido, por lo tanto se requiere de un electrodo de oxígeno para medir la respuesta. Si se requiere un valor real de kla, se deben aplicar teorías, modelos de sistemas y correlaciones pre establecidas. Para determinar kla en cultivos en crecimiento, se usan los siguientes métodos: Método de la bioreacción en estado estacionario: cuando usamos un sistema microbiano que consume oxígeno, el kla se calcula también a partir de la ecuación (2): J a = kla (C* - C) J a, C* y C deben ser conocidos, y la diferencia (C* - C)lo suficientemente grande. Ej: para el oxígeno, J a (OTR) será igual a la diferencia de las fracciones molares de oxígeno a la entrada y a la salida, multiplicadas por las velocidades de gas a la entrada y la salida.

28. Velocidad de transferencia de oxígeno (OTR) = velocidad de consumo de oxígeno (OUR) . C*, teniendo en cuenta la presión parcial de oxígeno (C* = p / H), y C puede leerse usando un electrodo de oxígeno disuelto. Método dinámico: Cuando el flujo de aire es temporariamente reducido (se corta), ó bien es reemplazado por nitrógeno en un cultivo que respira. kla para el oxígeno se vuelve cero, y la concentración de oxígeno disuelto cae rápidamente. La velocidad de disminución, dC / dt representa a la velocidad de consumo de oxígeno (q). Cuando se restablece la velocidad de flujo de oxígeno, la concentración retornará a su valor inicial. Con la ecuación (2) J a = kla (C* - C) se determina kla, ahora el término J a es igual a dC / dt + q. Este método es aplicable sólo para fermentadores pequeños (< 100 l), porque para fermentadores grandes la composición de la fase gaseosa no será uniforme después de dispersar con nitrógeno (el hold up del gas debe built up aún cuando se corta el flujo de gas). En cualquier caso se necesita un electrodo de oxígeno.

29. El oxígeno como sustrato El crecimiento en un cultivo microbiano con un sustrato limitante se expresa como: S μ = μmáx ------------ KS + S Con el oxígeno como sustrato S = C, que es la concentración de oxígeno. Cuando la velocidad de crecimiento en la fase de equilibrio se relaciona con la velocidad específica de absorción de oxígeno, se establece la ecuación siguiente: CL QO2 = Qm ------------- KO2 + CL K02 : cte de Michaelis Menten para el oxígeno QO2 : velocidad específica de toma de oxígeno / peso seco celular (mM oxígeno / gr hr) Qm : velocidad específica máxima de toma de oxígeno Cuando el valor Qm se relaciona con la biomasa / l, se obtiene la velocidad de absorción de gas y de toma de oxígeno que se debe conseguir durante la fermentación. x Qm = kLa (c* - cL) (mM oxígeno / l hr) x: concentración de células (peso seco gr / l)

30. La velocidad de absorción de gas no es constante durante la fermentación ya que si un sustrato diferente del oxígeno se hace limitante, como sucede al final de la fase logarítmica, el valor puede ser reducido. Durante la fermentación de los organismos unicelulares y los productores de micelio existe una diferencia característica en la velocidad de absorción de oxígeno. Durante el crecimiento logarítmico, la velocidad de absorción de oxígeno aumenta y el contenido en oxígeno en el caldo desciende hasta que se hace limitante. Después con bacterias unicelulares la velocidad de absorción de oxígeno es constante hasta que otro sustrato se haga limitante. Sin embargo en fermentaciones miceliales (estreptomicetos y hongos), la velocidad de absorción desciende cuando el oxígeno se hace limitante, debido al aumento en el volumen del micelio y al aumento en la viscosidad relativa. Concentración crítica de oxígeno La concentración crítica de oxígeno es el término utilizado para indicar el valor de la velocidad específica de absorción de oxígeno que permite la respiración sin impedimentos.

31. A velocidades de absorción de oxígeno que son más bajas que las concentraciones críticas, la velocidad de respiración se correlaciona con la concentración de oxígeno en la solución. Por encima de este valor no se observa dependencia entre la velocidad de respiración y el oxígeno disuelto. En fluídos Newtonianos, como los que existen en las fermentaciones de organismos filamentosos (Ej: durante la producción de novobiocina con Streptomyces niveus), la concentración crítica de oxígeno depende de las condiciones de la fermentación. Concentraciones críticas de oxígeno de algunos organismos Organismo Ccrít (mg/l) E. Coli 0.26 Penicillium chrysogenum 0.40 Sacharomyces cerevisiae 0.60 Pseudomonas ovalis 1.10 Torulopsis utilis 2.00

32. Velocidad de consumo de oxígeno y concentración de oxígeno disuelto, en condiciones de limitación de oxígeno Cultivo bacteriano Fermentación fúngica velocidad de absorción de oxígeno ------- CLconcentración de oxígeno disuelto

33. El efecto de la escala sobre la transferencia de masa Scale up:para bioreactores en gran escala, la transferencia de oxígeno es mejor que en una escala laboratorio ó un reactor de planta piloto. Esto se debe a una contribución > de la fase gaseosa (velocidad superficial del gas superior), y una fuerza impulsora más grande (presión en el espacio de cabeza alta y una presión hidrostática de cabeza. La mayoría del oxígeno es transferido en la región cerca del agitador. El caldo pasa a través del agitador hacia fuera y adentro del cuerpo del reactor y regresa de nuevo al agitador, se consume más oxígeno de lo que se transfiere y por lo tanto la concentración de oxígeno disminuirá. En un reactor tanque agitado grande ese camino de circulación del líquido puede llegar a ser de 10 m. Con una velocidad de líquido de 1 m/seg, el tiempo de circulación será de 10 seg. En el peor de los casos (no existe transferencia fuera de la región del agitador), pasarán 10 seg antes de que el oxígeno vuelva a depleted en el loop. Por lo tanto la concentración de oxígeno en el compartimento del fondo debe ser alta para que la depletion de oxígeno que perjudicaría al estado microbiano y la velocidad de

34. formación de producto, sea evitada. • Según la ecuación J a = kla (C* - C), la velocidad de transferencia de masa será < porque la fuerza impulsora (C* - C) en el fondo del reactor es baja porque C* y C son altos. • En un bioreactor grande la OTR tiene limitaciones máximas debido a las siguientes restricciones: • Pueden haber dificultades de construcción mecánicas en fermentadores muy grandes (> 300 m3). Además el transporte de líquido y el mezclado se vuelven muy lentos con respecto a la transferencia de masa y a la reacción, por lo tanto se ve afectada la velocidad de la reacción total. También hay limitaciones en el enfriamiento que se vuelven muy significativas. • La potencia promedio de entrada no debe exceder los 5 kW m3. Los microorganismos superiores pueden ser dañados en áreas donde el valor de potencia es localmente muy alto. Además los costos de energía y mantenimiento del motor también serán excesivamente altos. • La presión correspondiente a la velocidad superficial de aire debe estar por debajo de 0.1 m/seg. Los costos del compresor también son restrictivos y un hold up alto de aire aumentará con el costo del espacio que ocupe el caldo de fermentación en el reactor. • La presión en el espacio de cabeza tiene un máximo por razones mecánicas. Además la presión parcial de CO2 aumentará inhibiendo al crecimiento y a la producción. • La fase gaseosa no se puede considerar idealmente mezclada. La presión parcial

35. de oxígeno cae a medida que las burbujas viajan a través del reactor, y esto reduce la fuerza impulsora para la transferencia de masa. En reactores más grandes que 10 m3, el proceso de transporte de líquido y masa se vuelve lento. La transferencia de masa y circulación del líquido interfieren entre sí , por lo tanto deben ser tratadas juntas. En un reactor tanque agitado con un único agitador, la mayoría de la transferencia de oxígeno tiene lugar en la zona del agitador. • Scale down: los microorganismos pueden experimentar cambios continuamente cuando viajan a lo largo de un bioreactor grande, esto puede producir efectos indeseables. Para evitar estos problemas la escala grande se toma como un punto de referencia, y los efectos posibles se estudian por simulación de las variaciones sufridas en la escala grande en una escala experimental pequeña. • Factores limitantes de la escala grande como transferencia de masa, se llevan a una escala menor, se estudian y se los minimiza de una forma práctica y económica. • Hay algunas herramientas adecuadas para encontrar soluciones adecuadas al down – scaling: • Se usan dos reactores imitando las dos zonas más importantes de un reactor, y la recirculación del caldo entre esas dos zonas. El tamaño de los compartimentos y la velocidad de recirculación son críticas, igual que el tipo de flujo en cada reactor. Por Ej. Se va desde un flujo bien mezclado a un flujo pistón.

36. El desarrollo y verificación en gran escala de modelos de flujo matemáticos para tanques grandes se llevan a cabo y luego se usan para diseñar el experimento en la escala menor. • Se usan sistemas de ensayo microbianos bien caracterizados, en los cuales la sensibilidad a variaciones seleccionadas son conocidas. • Esto se ha estudiado extensivamente para mejorar la transferencia de oxígeno y el mezclado del sustrato que se usa como alimentación en reactores grandes.

37. Transferencia de oxígeno gas - líquido Debido a la importancia de los procesos de fermentación aeróbicos, la transferencia de masa gas – líquido es casi un sinónimo de la transferencia de oxígeno desde las burbujas de gas a un medio líquido. Como la velocidad volumétrica de transferencia de masa es proporcional a la diferencia entre la concentración de equilibrio (saturación) c*0 y el valor real de la concentración de oxígeno disuelto en el medio c0, es necesario conocer la concentración de saturación. La solubilidad del oxígeno disminuye a medida que aumenta la temperatura, y disminuye con la concentración de varios solutos presentes en el medio. Solubilidad del oxígeno en agua pura a una presión de oxígeno de 1 atm

38. Solubilidad del oxígeno a 25 ºC a 1 atm de presión en varias soluciones acuosas

39. Métodos para la determinación del coeficiente volumétrico de transferencia de masa para el oxígeno Método directo: La mayoría de los procesos de fermentación aeróbicos están equipados con analizadores de oxígeno y electrodos para medir la concentración de oxígeno disuelto. Se mide el contenido de oxígeno a la entrada y a la salida junto con la velocidad de flujo del gas, si es posible se trabaja en condiciones de flujo estacionario y se determina la velocidad de transferencia de oxígeno volumétrico, qt0, el cual en ee es igual a la velocidad de consumo volumétrico –q0. Así tenemos la ecuación siguiente: R: cte de los gases 8.314 J / mol ºK ó 0.08206 l atm / mol ºK, T (ºK), p0 es la presión parcial de oxígeno, y vg es la velocidad de flujo de gas. La mayoría de los analizadores dan el resultado como una fracción de moles de oxígeno en el gas. Cuando se usa aire normal, es suficiente analizar solamente la composición del gas a la salida. Sin embargo para bioreactores grandes es importante tener en cuenta la diferencia de presión a lo largo del reactor. Si se mide también la concentración de oxígeno disuelto, c0 en el medio, se puede calcular kla de:

40. Suposiciones • La concentración de saturación c*0 es la misma a través del reactor. • La diferencia de presión es pequeña y que la disminución en la presión parcial de oxígeno en la fase gaseosa es pequeña, si no es este el caso se debe usar la ecuación para la fuerza impulsora de la concentración: Este es un método simple y el que tiene una ventaja mayor para aplicarse en fermentaciones reales. Sin embargo se deben conocer medidas seguras del contenido de oxígeno, de las velocidades de flujo de gas y de la solubilidad del oxígeno en el medio. Además la tensión de oxígeno no debe cambiar durante la medida, ya que suponemos estado estacionario ó pseudo estacionario como un requerimiento estricto.

41. Método dinámico: se basa en la medida de la concentración de oxígeno disuelto en el medio. No requiere de medidas de la composición del gas, por lo tanto es un método barato. El balance de masa dinámico para la concentración de oxígeno disuelto es: Si se corta el suministro de gas, qt0 es cero y el primer término del lado derecho de la ecuación cae a cero. La concentración de oxígeno disuelto disminuye a una velocidad igual a la velocidad de consumo de oxígeno, - q0 que puede por lo tanto determinarse midiendo la concentración de oxígeno disuelto c0 (t). Si q0 es independiente de c0 la concentración de oxígeno disuelto disminuye como una función lineal con el tiempo. Cuando se restablece el suministro de gas, la concentración de oxígeno disuelto aumenta de nuevo al nivel inicial, y usando el valor promedio estimado para q0, se puede determinar el valor de kla midiendo el perfil de oxígeno disuelto. El método es simple y puede aplicarse durante una fermentación real. Exige que q0 se determine correctamente cuando se corta el suministro de gas. La mayoría de los electrodos para medir la concentración de oxígeno disuelto, desafortunadamente tienen un tiempo de respuesta próximo al tiempo característico para el proceso de transferencia de masa, y por lo tanto las concentraciones medidas están influenciadas por la dinámica del aparato de medida, Ej un electrodo de oxígeno.

42. El método dinámico puede aplicarse para condiciones donde no hay reacción (q0 es cero). Esto es interesante cuando se estudia la influencia de parámetros operativos, Ej: velocidad de agitación y velocidad de flujo de gas, sobre el coeficiente volumétrico de transferencia de masa en un medio modelo. Después de una etapa de cambio en la concentración a la entrada del gas, hay cambios dinámicos en la concentración de oxígeno disuelto y en la concentración de oxígeno a la salida. Debido a la dinámica baja de los electrodos de oxígeno, es preferible aplicar medidas del gas agotado para la determinación del coeficiente de transferencia de masa. (Se debe usar un balance de masa para el oxígeno en la fase gaseosa). Sin embargo antes de aplicar esto es importante chequear con cuidado la dinámica del analizador de gas. Método del sulfito: Es posible determinar la transferencia de oxígeno usando un modelo de oxígeno que se consume en una reacción química. El método tradicional del sulfito se basa en la oxidación de sulfito a sulfato por el oxígeno: La reacción es catalizada por un nº de iones metálicos, que pueden ser impurezas. Sin embargo se agrega una cantidad conocida de Cu (10-3 M) ó sales de Co para hacer la reacción casi instantánea. Así la velocidad de consumo del sulfito se determina solamente por la velocidad a la cual el oxígeno es transferido desde la fase gaseosa.

43. De la ecuación anterior se tiene que: Consideramos: La concentración de oxígeno disuelto, c0 es cero debido a que la reacción con el sulfito es muy rápida. La velocidad de reacción se determina midiendo la concentración de sulfito en muestras que se toman a intervalos de tiempo una vez iniciada la reacción. La concentración de sulfito en las muestras se determina agregando yodo en exceso, por lo tanto se hace una titulación por retroceso con tiosulfato de sodio, usando almidón como indicador. Las reacciones son las siguientes: • Para aplicar el método, es necesario conocer la concentración de saturación de oxígeno en una solución de sulfito concentrada, como esto no se conoce se usa la solubilidad del oxígeno en soluciones de sulfato, que es 1.02 mM a 25 ºC para una solución 0.25 M de sulfato. • Este método es simple de usar pero tiene una serie de desventajas: • La oxidación del sulfito puede aumentar la absorción de oxígeno, ya que la

44. reacción rápida puede ocurrir no solamente en el volumen de líquido sino también en la película líquida. La suposición de un perfil lineal de concentración es por lo tanto cuestionable • Otra complicación es el efecto de coalescencia reducida del sulfito en el volumen de líquido, que resulta en un área interfacial específica más grande. • Ambos, el aumento de transferencia de masa debido a la reacción en la película, y a los efectos de coalescencia reducida del sulfito, pueden conducir a una sobreestimación del valor de kla comparado al que se encuentra en un medio de fermentación normal. Esto es una desventaja significativa del método. • Este método no se puede aplicar a una fermentación real, ya que los microorganismos morirían. • Método delperóxido de hidrógeno: es un método químico como el sulfito pero tiene algunas ventajas sobre este. • En este método se mide la transferencia de oxígeno desde el líquido a la fase gaseosa. El oxígeno es generado por la descomposición de H2O2 catalizada por una enzima según: La reacción es de primer orden con respecto al agua oxigenada y a la enzima catalasa. Pasa un flujo volumétrico constante de aire, y después de la adición de una cantidad conocida de enzima, se alimenta en forma continua agua oxigenada al reactor.

45. Inicialmente el peróxido de hidrógeno se acumulará en el medio del reactor hasta que se establece el estado estacionario, entonces la velocidad de descomposición del peróxido de hidrógeno –qag oxes igual a la mitad de la velocidad de transferencia de oxígeno de la fase líquida a la fase gaseosa: Notar que ambos términos de esta ecuación son negativos, porque el oxígeno se genera en el líquido. La velocidad volumétrica de descomposición del peróxido de hidrógeno se calcula de la velocidad volumétrica de adición y de la concentración de peróxido de hidrógeno en el líquido agregado , de acuerdo a: La concentración interfacial de oxígeno se calcula a partir de la presión parcial de oxígeno de la fase gaseosa. (DOT = c0 / c*0 > 1) Es necesario suponer mezclado de la fase gaseosa para determinar la concentración interfacial de oxígeno. Hickman suposo mezclado completo de ambas fases gaseosa y líquida, que da:

46. Este método es fácil de implementar. Para estimar el valor de kla se debe medir la velocidad de adición del peróxido de hidrógeno y la concentración de oxígeno (DOT) en la fase líquida. Una medida independiente (pero mucho menos segura) de qt0 es obtener de la diferencia en contenido de oxígeno entre ving y voutg como en el método directo. Comparando con el método del sulfito, una ventaja significativa es que el valor de kla no aumenta por la concentración de la catalasa en un rango bastante amplio. El riesgo de aumentar la transferencia de masa debido a la reacción en la película líquida es muy pequeño, y el efecto de propiedades por coalescencia por la catalasa también es muy pequeño. Este método se puede aplicar con buenos resultados para medir kla en reactores de escala industrial y también con fluídos viscosos y medios no Newtonianos.

47. Métodos por trazadores: 85Kr es un isótopo volátil que emite radiación beta y gamma. Se inyecta el isótopo en el medio y luego se mide la radioactividad en el gas agotado, es posible determinar el coeficiente volumétrico de transferencia de masa para Kr. Se supone que existe una relación constante entre los valores de kla para diferentes gases en las mismas condiciones, el valor estimado de kla para Kr se usa para calcular el valor correspondiente de kla para el oxígeno. Pedersen et al: Aproximadamente se encuentra el mismo valor si uno usa la relación entre los coeficientes de difusión molecular para las dos especies: Este método es fácil de implementar, y es bien apropiado para medir ambos, medios modelos y bajo condiciones de fermentación real. La principal desventaja es la radioactividad, que obviamente limita su aplicación en la industria a pesar de que el isótopo es muy volátil y la radiación baja a los pocos minutos de su inyección. Kr es completamente inerte en conecciones con fermentaciones.

48. Transferencia de Masa Convectiva Forzada • Grupos Adimensionales – Conceptos Generales • A menudo se requiere un mezclado mecánico vigoroso para obtener velocidades de biomasa crecientes, de consumo de sustrato ó de formación de producto. • Las funciones que rigen la agitación mecánica (y en algunos casos son dominantes) que influyen sobre el flujo convectivo de las burbujas que suben libremente ó que caen dispersadas son: • La presión dinámica alta cerca de la punta del agitador ó en otros aparatos que producen burbujas pequeñas, aumenta con el área, a´. • El fluído de fermentación puede contener una suspensión de sólidos u otra fase líquida, que tiende a subir ó caer en el tanque. Los agitadores mecánicos proveen una dispersión volumétrica uniforme de estas dos fases. • Para burbujas de gas de un dado tamaño vigorosamente agitadas, kl no varía significativamente con la potencia de entrada, ya que la velocidad relativa del gas ó del fluído es dominada por las diferencias de densidad. • En agitación turbulenta, D disminuye y aumenta a´para un hold up dado. Cambian el tamaño de las burbujas y kl, según D. • El tamaño de micelios, slimes microbianos, pellet de hongos, etc disminuyen con la agitación. Se puede obtener un < rendimiento de producto a velocidades de agitación altas por daños celulares ó a enzimas extracelulares.

49. La suspensión líquido – células puede ser viscosa tal que únicamente una agitación mecánica provea un mezclado en todo el volumen del medio. • En convección forzada, la acción de un trabajo mecánico aplicado produce una velocidad característica con otros movimientos que pueden ser escalados. • Para agitación mecánica existen dos factores: la fluctuación de la velocidad del fluído u, y la velocidad de punto del agitador uique es proporcional a Ni Di , donde Ni es la velocidad de rotación del agitador en revoluciones por unidad de tiempo, y Di es el diámetro del agitador. • Considerando los balances de convección forzada para la masa total, especies, y momentos producen los grupos adimensionales siguientes, consideramos u como la velocidad característica:

50. Alternativamente en sistemas agitados, la dimensión característica es el diámetro del agitador Di , y la velocidad de referencia es Ni Di. El subídice i hace referencia al cambio de escala. El nº de Froude tiene también otras definiciones. Para transferencia de masa en una suspensión de partículas “buoyant neutrlmente”,es: L es la longitud del reactor. Como el nº de Froude representa la contribución de la dinámica de la superficie libre vs el mezclado mecánico, la distancia de la superficie del fondo del tanque el nº de Froude debe considerarse. Cuando tengo dos fases, el nº de Froude es: