Bacteriófagos líticos para Salmonella Enteritidis e

1. Bacteriófagos líticos para Salmonella Enteritidis e Salmonella Typhimurium isolados de fezes de aves. L. Fiorentin*1;N.D. Vieira1 e S. Barros2 1Embrapa Suínos e Aves - Concórdia -SC. 2Laboratório Regional de Diagnóstico - UFPEL- Pelotas, RS. INTRODUÇÃO A seleção de bactérias resistentes aos antimicrobianos e a possível veiculação de resíduo nos alimentos, tem gerado pressão para a redução do seu uso em animais. Paralelamente, os mercados se tornam mais exigentes na a redução das contaminações por bactérias que afetam o ser humano, e que são controladas também através do uso de antimicrobianos. Este trabalho relata a obtenção e a caracterização de bacteriófagos líticos para Salmonella Enteritidis e Salmonella Typhimurium a partir de fezes de aves domésticas, os quais podem ser de grande valia no controle de Salmonelas em aves e na redução da contaminação de seus subprodutos. Figura 2. Ultra estrutura e esquema representativo aproximado, respectivamente, dos bacteriófagos isolados. Figura 1. Cultura de Salmonela apresentando placas de lise causada pelo bacteriófago CNPSA 1. MATERIAL E MÉTODOS Bateriófagos líticos para S. Enteritidis fago tipo 4 e S. Typhimurium (ATCC 14028) foram pesquisados em fezes de 40 poedeiras coloniais, 45 reprodutoras comerciais de corte, 13 emas e 9 “pools” de fezes de pássaros diversos. Um grama de fezes foi inoculado em 10mL de uma cultura exponencial de Salmonela em caldo nutritivo contendo 5mM de MgSO4, e incubado por 18 horas a 37°C sob agitação (200rpm). Esta cultura foi então tratada com 5% de clorofórmio, centrifugada e 10L do sobrenadante aplicados sobre uma camada de agarose contendo Salmonela (cultivo “overlay”). Os cultivos foram incubadas por 24 horas a 37°C (Kudva et al., 1999) e as placas de inibição do crescimento bacteriano (Fig. 1) colhidas para clonagens dos bacteriófagos e investigações adicionais. A capacidade de lise dos bacteriófagos para as duas Salmonelas foi comparada através do RTD (“Routine Test Dilution”). Uma multiplicação do bacteriófago foi procedida com a Salmonela utilizada para seu isolamento, o cultivo tratado com clorofórmio e aplicada em diluições exponenciais sobre “overlay” de cada Salmonela. Uma cultura de cada bacteriófago foi imersa em agarose, fixada e submetida a microscopia eletrônica com coloração por acetato de uranil a citrato de chumbo para a visualização de sua ultra estrutura. Bacteriófagos foram isolados com precipitação através de PEG8000 (Helms et al., 1987) e o seu DNA purificado por extração fenólica para análise com nucleases comparação em RAPD (“Random Amplified Polymorphic DNA Analyses”). Os fragmentos amplificados foram separados por eletroforese (110V por 1:30 horas) em gel de agarose a 2% corado com brometo de etidium. Figura 3. Perfis de RAPD. Da esquerda para a direita estão os bacteriófagos CNPSA 1, CNPSA 3, CNPSA 4, e CNPSA 5 ampliados com o “primer” 5’-d[GGTGCGGGAA]-3’. Figura 4. Ultra estrutura dos bacteriófagos (setas) em uma célula de Salmonela. CONCLUSÃO Bacteriófagos líticos para S. Enteritidis e S. Typhimurium, com morfologia de cabeça e cauda e diferenciáveis pelo RAPD, ocorrem naturalmente em aves domésticas no Brasil. Os bacteriófagos isolados serão avaliados como forma de auxiliar no controle de contaminações por Salmonelas em aves e seus produtos. RESULTADOS E DISCUSSÃO Cinco bacteriófagos foram isolados e denominados CNPSA 1, CNPSA 2, CNPSA 3, CNPSA 4, e CNPSA 5, sendo 4 de galinhas coloniais enquanto o CNPSA 5 foi isolado de um “pool” de fezes de pássaros criados em cativeiro. Apenas o CNPSA 2 não permitiu estudos posteriores devido a perda de viabilidade, enquanto os demais foram caracterizados. Todos os bacteriófagos mostraram-se com ultra estrutura de cabeça (80 a 120nm) e cauda (Figuras 2 e 4). Ensaios com nucleases demonstraram que os bacteriófagos isolados tem dsDNA como seu material genético e o RAPD permitiu diferencia-los, a exceção de CNPSA 4 e CNPSA 5, os quais tiveram o mesmo perfil de ampliação com 6 diferentes “primers” (Figura 3). Ensaios de RTD demonstraram que a capacidade de lise de cada bacteriófago para ambas as Salmonelas não varia além de uma diluição logarítmica do estoque aplicado sobre “overlay” da Salmonela.. BIBLIOGRAFIA Helms C, Dutchik JE, Olson MV. A lambda protocol based on purification of phage on DEAE cellulose. Methods of Enzymology, 1987; 153:69-82. Kudva IT, Jelacic S, Tarr PP, Youderian P, Hovne CJ. Biocontrol of Escherichia coli O157 with O157-Specific bacteriophages. Applied and Environmental Bacteriology, 1999; 65: 3767-3773. AGRADECIMENTO Os autores agradecem a Anaí Giane de Sousa pelo auxílio laboratorial.