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Genética molecular dos sistemas eritrocitários: importância na prática clínica

Genética molecular dos sistemas eritrocitários: importância na prática clínica. Lilian Castilho. I. RAPH. JMH. GLOB. OK. GIL. IN. KN. ABO. KX. CR. H. GE. (12). MNS (43). CH/RG. LW. CO. P. DO. SC. XG. RH (48). YT. DI (21). FY. KELL (24). JK. LU (20). LE.

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Genética molecular dos sistemas eritrocitários: importância na prática clínica

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Presentation Transcript

  1. Genética molecular dos sistemas eritrocitários: importância na prática clínica Lilian Castilho

  2. I RAPH JMH GLOB OK GIL IN KN ABO KX CR H GE (12) MNS (43) CH/RG LW CO P DO SC XG RH (48) YT DI (21) FY KELL (24) JK LU (20) LE Sistemas eritrocitários . Constituídos por antígenos de grupos sanguíneos definidos por aloanticorpos Diversidade: Sistemas 29 Locus 34 Antígenos 239 Alelos >620 www.bioc.aecom.yu.edu/bgmut/index.htm

  3. Modelo de membrana: inserção dos antígenos de grupos sanguíneos GPA/GPB (MNSs) GPC/GPD (Gerbich) CD239 (Lutheran, B-CAM) ICAM-4 (LW) ERMAP (Sc) CD44 (Indian) AChE (Yt) CD99 (Xg) Dombrock (ART4) DAF (CD55, Cromer) CD147 (Ok) CD108 (JMH) CR1 (CD35; Knops) NH CD238 (Kell) 2 Emm Band 3 (Diego) COOH NH Rh 2 Kx AQP-1 (Colton) CD234 (Duffy) ABO Kidd Hh AQP-3 (GIL) P1 Lewis NH CD151 (Raph) P 2 I k P Outside COOH NH COOH COOH NH 2 2 GPI- Carbo- Type I Type II Multipass linked hydrate Single- Single- pass pass Reid, 2004

  4. Antígenos de grupos sanguíneos: produtos de genes • 28/29 genes identificados • polimorfismos de GS definidos ao nível genético • antígenos carreados em proteínas são codificados diretamente pelos genes • antígenos carbohidratos estão sob o controle de genes que codificam glicosiltransferases • análise molecular dos genes de GS pode ser útil na clínica • entendimento das bases moleculares de GS permite explorar a função da proteína www.bioc.aecom.yu.edu/bgmut/index.htm

  5. Antígenos de grupos sanguineos estão localizados em moléculas funcionais P ABO Lewis GLOB H I Carboidratos Kell Yt MNS Scianna Dombrock Gerbich Enzimas Glicoproteinas de estrutura ou função desconhecida Rh Kidd Diego Colton GIL Kx Ch/Rg Cromer Knops LW Xg Duffy Lutheran Indian Raph JMH Oka Transporte e canais Regulação de complemento Moléculas de adesão

  6. Mecanismos moleculares que levam à diversidade dos antígenos de grupos sanguíneos • Inserção: Nucleotídeo (s) : Rh, Colton • Duplicação Exon: Gerbich • Splicing alternativo: S-s- • Conversão gênica ou recombinação MNS, Rh, Ch/Rg • SNPs (single nucleotide polymorphisms) : maioria • Transcrição: GATA • Deleção Gene, Exon, Nucleotídeo (s): ABO, MNS, Rh, Kell, Duffy, Dombrock, etc

  7. SNPs (mutações de ponto missenses) AAGTCAGCTGGACTTCGAAGATGTATGGAATTCTTCCTATGGTGTGAATGATTCCTTCCCAGATGGAGACTATGATCCAACCTGGAAGCAGCTGCCCCCTGCCACTCCTGTAACCTG (FY B) A (Asp) (FY A) G (Gly) • Duffy: Fya/Fyb • Kidd: Jka/Jkb • Lutheran: Lua/Lub • Dombrock: Doa/Dob • RH: C/c; E/e • MNS: S/s • Kell: K/k, Kpa/Kpb, Jsa/Jsb • Diego: Dia/Dib

  8. Transcrição Mutações no gen promotor que afetam a expressão do antígeno na hemácia GATA box FY A/FY B TATC 1 2 FY Normal FY B 1 2 TACC FY Mutado* * Fenótipo Fy(a-b-)

  9. Rearranjos gênicos Rhesus box Rhesus box SMP1 RHD RHCE RHCE 6 7 8 9 1 2 3 4 5 10 SMP1 RHD DANIELS, 2002

  10. Métodos de análise de DNA • Amplificação do DNA por PCR • PCR-RFLP • PCR-alelo-especifico • PCR-multiplex • Amplificação (PCR) + sonda-especifica (probe)-Real time PCR • TaqMan • Molecular beacons • Microarray – chips

  11. PCR-RFLP (Polimorfismo Duffy) TCCCCCTCAACTGAGAACTCAAGTCAGCTGGACTTCGAAGATGTATGGAATTCTTCCTATGGTGTGAATGATTCCTTCCCAGATGGAGACTATGATCCAACCTGGAAGCAGCTGCCCCCTGCCACTCCTGTAACCTG (FY B) GATCC (ausência de sítio Ban I) G (FY A) GGTCC (sítio Ban I) CTGGATGACTCTGCACTGCCCTTCTTCATCCTCACCAGTGTCCTGGGTATCCTAGCTAGCAGCACTGTCCTCTTCATGCTTTTCAGACCTCTCTTCCGCTGGCAGCTCTGCCCTGGCTGGCCTGTCCTGGCACAGCTGGCTGTGGGCAGTGCCCTCTTCAGCATTGTGGTCC CGTCTTGGCCCC AGGGCTAGGTAGCACTCGCAGCTCTGCCCTGTGTAGCCTGGGCTACTGTGTCTGGTATGGCTCAGCCTT

  12. RFLP para genotipagem Duffy FY B FY A/FY B FY B/FY B FY A/FY A 100 bp 306pb 86pb PCR 400pb 392 pb 300pb FY A 306pb 96pb 210pb 86pb 200pb 210pb Ban I novo sítio Ban I sítio comum 100pb 96pb 86pb

  13. PCR Alelo-Especifico (AS-PCR): Ss S-específico s-específico 100 pb 100 pb s+ s+ s+ S+ S+ s- s- S- S+ S+ 1 2 3 4 5 B 1 2 B 3 4 5 CI 205pb

  14. PCR Multiplex: RHCE Cc e RHDy RHD/RHCc RHD y RHDcc 100bp I4 RHD RHC RHDy RHc Ex7 RHD

  15. Real Time PCR DNA fetal no Plasma materno

  16. Oligo 1 Oligo 2 Oligo 3 Microarray – Tecnologia Chip 4000 ENCODED BEADS 0.3 mm

  17. A A T G T T G G A A A C C C C C C C C C C C C C G G G G T T T T T T A A G G G G C C SIGNAL INTENSITY PAIRS OF GENETIC MARKERS Microarray – Tecnologia Chip MULTIPLEXED ANALYSIS OF POLYMORPHISMS ASSAY IMAGE ON-CHIP ELONGATION X T C FY A FY B Match Mismatch

  18. DECODING IMAGE ASSAY IMAGE Microarray – Tecnologia Chip Aquisição da imagem automática

  19. GENÓTIPO: FY, Fy-265 , GATA AB, AA, AA Do-624, -793, -323, -350.-378 AA K BB JK AB GPB BB GPA AB LW, Co, Sc & Di AA Lu AB Microarray – Tecnologia Chip HEA-18

  20. Fontes de DNA que podem ser utilizadas para genotipagem • Sangue (Leucócitos) • Células do epitélio bucal • Urina (células no sedimento urinário) • Líquido amniótico (amniócitos) • DNA fetal em plasma materno

  21. Genética molecular dos sistemas eritrocitários: aplicações Em doadores • Genotipagem em larga escala para identificação de antígenos comuns e raros (Programa de hemácias fenotipadas) • Produção de painéis complementares • Zigozidade D, Fya, Fyb : controle de qualidade de reagentes • Determinação dos tipos de D fraco e D parcial • Identificação de novos alelos • Seleção limitada de anti-soros

  22. Genética molecular dos sistemas eritrocitários: aplicações Em pacientes • Resolução de casos clínicos em situações que os testes de hemaglutinação não fornecem resultados seguros (pacientes recém-transfundidos, pacientes portadores de AHAI aloimunizados) • Resolução de discrepâncias ABO e Rh • Determinação de microquimerismo após transplante de stem cell alogênico • Identificação de fenótipos fracos e deprimidos (D fraco, e fraco) • Investigação e confirmação de fenótipos raros (DI, DO, SC, CO) • Identificação de variantes raras (D parcial + e parcial) • Identificação de novos alelos

  23. Genética molecular dos sistemas eritrocitários: aplicações Medicina materno-fetal • Zigozidade do gene RHD paterno • Genotipagem RHD fetal • DNA de amniócitos • DNA de origem fetal na circulação materna (usar DNA de plasma materno)

  24. Genotipagem eritrocitária na prática clínica Caso clínico 1: • Paciente politransfundido aloimunizado com anti-E e provável anti-Jkb e história de transfusão recente • Fenotipagem: R2r, K-k+, Fy(a+b-), Jk(a-b+) • Teste complementar: genotipagem RH, KEL, FY e JK

  25. Genotipagem eritrocitária na prática clínica Caso clínico 1: • Genotipagem:RHD+ RHCE cc ee, K2K2, FY A/FY A, JK A/JK A 100 pb 100 pb RH ee K2K2 FY A/FY B FY A/FY A RHDcc 100pb JK A/JK B JK B/JK B JK A/JK A 100 pb • Componente selecionado para a transfusão: • Fenótipo deduzido do genótipo: R0r, K-, Fy(b-), Jk(b-)

  26. Genotipagem eritrocitária na prática clínica Caso clínico 2: • Paciente politransfundido com TDA positivo (4+) eluato e soro positivos 4+ com todas as células, história de transfusão recente e evidência clínica de diminuição da sobrevida de hemácias transfundidas • Fenotipagem do paciente: ? • Genotipagem do paciente: RHD-, RHCE cc ee, K2K2, FY A/FY B, JK A/JK B, Ms/Ns • Análise sorológica complementar adsorções alogênicas com hemácias rr, K-, S- para retirada do autoac • Conclusão: Aloanticorpos detectados:anti-E, -K • Componente selecionado para a transfusão: Fenótipo rr, K-, S-

  27. Genotipagem eritrocitária na prática clínica Caso clínico 3: • Paciente falciforme aloimunizado com anti-E, anti-K e anti-Jka recebendo sangue fenótipo compatível • Fenotipagem do paciente: R0r, K-k+, Fy(a-b-), Jk(a-b+) • Genotipagem do paciente: RHD+, RHCE cc ee , K2K2,FY B/FY B (Gata mutado), JK B/JK B • Conclusão: Paciente pode receber sangue Fy(b+) • Componente selecionado para a transfusão: • Fenótipo R0r, K-, Fy(a-b+), Jk(a-)

  28. Genotipagem eritrocitária na prática clínica Caso clínico 4: • Paciente sexo feminino, 27 anos, história de 1 transfusão anterior, nenhuma gestação ou aborto • Aloimunizada com anti-D • Fenotipagem da paciente: D- • Fenotipagem do doador da hemácia transfundida: D-

  29. Genotipagem eritrocitária na prática clínica Caso clínico 4: Ctl 100pb RHDF1 RHD- RHD+ RHD- 50pb RHD+ 245pb (RH D) (RH CE) 236pb 160pb (RH CE) (RH D) 115pb Exon 6 Intron 4 Exon 10 • Genotipagem da paciente: RHD- • Genotipagem do doador: D fraco tipo 1

  30. Genotipagem eritrocitária na prática clínica Caso clínico 5: • Paciente falciforme aloimunizado com anti-D e anti-K • Fenotipagem do paciente: R0r (D fraco), K-k+ • Genotipagem do paciente: RHD+, RHCE cc ee , K2K2 100 pb 100 pb RH ee K2K2 RHDcc 100bp

  31. DAR DAR PCR 262pb 234pb 45pb Genotipagem eritrocitária na prática clínica Caso clínico 5: • Genotipagem complementar: D parcial DAR • Componente selecionado para a transfusão:Fenótipo rr, K-

  32. Aspectos práticos • D fracos tipos 1> 4> 3> 2 mais frequentes • Anti-D IgM: pacientes; anti-D IgG:doadores • Reatividades < 1+ com anti-D IgG na AGH podem indicar a presença de DAR, DVI, DHMi

  33. Genotipagem eritrocitária na prática clínica Caso clínico 6: • Paciente falciforme aloimunizado com anti-e like, anti-E e provável anti-D • Fenotipagem do paciente: B, D+C+E-c+e+ • Sangue selecionado para a transfusão: R2R2 e rr (incompatível) • Genotipagem do paciente: RHD+, RHCE cc ee , • Genotipagem complementar (e-parcial): ces (hrB-) • Genotipagem complementar (D-parcial): DIIIa • Componente selecionado para a transfusão: Fenótipo hrB-, D-

  34. Aspectos práticos • Pacientes descendentes de Africanos com variantes do gene RHCE (ceMO, ceEK, ceAR, ceBI) podem desenvolver anti-e-like, incluindo anti-hrB, anti-hrs • Estes pacientes podem também desenvolver anti-D (DIIIa, DAR) Anti-D RHD parcial RhCe e-parcial: -hrB/-hrs RHD e parcial Anti-D+e-like(-hrB/-hrs) RHD parcial e parcial

  35. Aspectos práticos DIIIa e DAR em pacientes com anemia falciforme Normal D DIIIa DAR Pacientes DIIIa/DAR 4 122 130 2 2 3,1 1,5 1,5 % 94 3pacientes desenvolveram anti-D (1 DAR e 2 DIIIa/DAR) Castilho et al, 2004

  36. Genotipagem eritrocitária na prática clínica Caso clínico 7: • Paciente falciforme aloimunizado com anti-C e anti-K • Fenotipagem do paciente: R2R2, K-k+ • Genotipagem do paciente: RHD+, RHCE cc Ee , K2K2 • Genotipagem complementar: VS+, Cys16 • Conclusão: e+f (variante): paciente R2r • Componente selecionado para a transfusão:Fenótipo R2r K-

  37. Aspectos práticos Cys16 e VS associados ao alelo Rhce em pacientes falciformes Haplótipos 16Cys 16Trp VS+ VS- 0 2 0 *R2r (2) 2 56 6 0 50 Ror (56) 2 0 r r (2) 0 2 * Anti-soros monoclonais anti-e (MS63) anti-e (MS16, MS21) Rodrigues & Castilho, Vox Sang.2002

  38. Genotipagem eritrocitária na prática clínica Caso clínico 8: • Paciente talassêmico aloimunizado com anti-c, anti-K, anti-Jka e outro aloac? Recebendo sangue fenótipo compatível • Fenotipagem do paciente: R0r, K-k+, Fy(a+b-), Jk(a-b+), M+N+S+s+ • Genotipagem do paciente: RHD+ RHCE cc ee, K2K2, FY A/FY A, JK B/JK B, MS/Ns

  39. Genotipagem eritrocitária na prática clínica Caso clínico 8: • Análise molecular complementar: DO A/DO A • Análise sorológica complementar adsorção com hemácias R0r, K-, Fy(b-), Jk(a-), Do(b+) /eluição): anti-Dob • Conclusão: Paciente portador de anti-c, -K, -Jka, Dob DOA/A DOB/B DOA/A • Componente selecionado para a transfusão:Fenótipo R0r, K-, Fy(b-), Jk(a-), Do(b-)

  40. Aspectos práticos Genotipagem Dombrock • Identificação de anticorpos anti-Do • Possibilidade de genotipar os doadores e selecionar hemácias antígeno-negativas • Maior aproveitamento transfusional IMPORTÂNCIA CLÍNICA

  41. Genotipagem eritrocitária na prática clínica Caso clínico 9: • Gestante aloimunizada (200 semana) • Anticorpo identificado: Anti-D (título: 512) • Fenótipo da paciente: rr • Teste complementar: Zigozidade paterna,genotipagem fetal através do plasma materno

  42. RHD- RHD- Ctl+ Ctl+ Genotipagem eritrocitária na prática clínica Zigozidade paterna Genotipagem RHD fetal RHD+/D- PCR 3100pb 1888pb 744pb 564pb 397pb I4 Ex10 • Gestação não monitorada

  43. Genotipagem eritrocitária na prática clínica Caso clínico 10: • Gestante aloimunizada (120 semana) • Anticorpo identificado: Anti-D (título: 512) • Fenótipo da paciente: rr

  44. Genotipagem eritrocitária na prática clínica Zigozidade paterna Genotipagem RHD fetal RHD+/D+ RHD+ RHD- RHD- RHD+ PCR 3100pb 1888pb 744pb 397pb • Gestação sistematicamente monitorada

  45. Situações em que genótipo e fenótipo podem não corresponder • Transfusões crônicas/maciças • Alteração no gene afetando: transcrição (Fyb-); splicing (S-s-); introdução de stop codon (Fy(a-b-), Rhnull), ou mutação que afeta a estabilidade da proteina na membrana da célula (Fyx) • Crossing overs e outros rearranjos gênicos (RHD/RHCE) • Alteração em outro gene que está associado com a expressão do gene : RHAGRhnull

  46. Implementação da genotipagem para uso clínico • Amostras de sangue fenotipadas devem ser analisadas por PCR em estudo cego para avaliação do método • O número de amostras usadas na validação de um teste deve incluir o máximo de variantes genéticas presentes na população para a qual o teste vai ser utilizado • População Europeia Vs População Brasileira • Revalidação do teste com novas variantes • Participação em testes de proficiência

  47. Genética molecular dos sistemas eritrocitários na população brasileira • Melhoria da qualidade e exatidão dos resultados imunohematológicos • Determinação de novas variantes alélicas não descritas em outras populações (DIA/166A, FY145, Rhnull) • Identificação de variantes alélicas de origem Africana (GATA, RHD, RHD-CE-Ds, VS, DIIIa, DAR) • Elaboração de protocolos de genotipagem eficientes

  48. Genética molecular dos sistemas eritrocitários Genotipagem de grupos sanguíneos na clínica requer: • Conhecimento em grupos sanguíneos • Experiência na interpretação das reações de PCR utilizadas • Obtenção dos achados sorológicos e da história clínica do paciente antes de interpretar os resultados da genotipagem • Conhecimento dos genes que codificam os antígenos de GS e suas formas variantes (fenótipos e genótipos podem não correlacionar) na população estudada

  49. Genética molecular dos sistemas eritrocitários • A genotipagem de grupos sanguíneos é uma ferramenta útil na medicina transfusional e apresenta gradualmente um número crescente de aplicações. Torna-se poderosa quando associada a hemalutinação • Os métodos moleculares permitem obter um melhor conhecimento da distribuição dos grupos sanguíneos e suas bases moleculares na população brasileira • Achados moleculares na população brasileira ajudam a desenvolver protocolos mais seguros para genotipagem de grupos sanguíneos em nossos laboratórios

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