LA FABRICATION INDUSTRIELLE DES VACCINS ET LEUR CONTRÔLE Jean Fran ç ois SALUZZO Consultant WHO

1. LA FABRICATION INDUSTRIELLE DES VACCINS ET LEUR CONTRÔLEJean François SALUZZOConsultant WHO

2. 1. LA FABRICATION DES VACCINS - La production de principe actif - La mise sous forme pharmaceutique 2. LA QUALITE DES VACCINS 3. LES SPECIFICITES DE LA PRODUCTION DE VACCINS

3. VACCINS VIVANTS VACCINS INERTES Vaccins bactériens BCG Méningite Typhoïde Pneumocoque Haemophilus* Coqueluche Coqueluche acellulaire Diphtérie Tétanos Typhoïde RougeoleRubéoleOreillonsVaricelleFièvre Jaune Vaccins viraux Polio orale Rotavirus Rage Polio inject. Hépatite A Encéphalite japonaise Grippe Papillomavirus Hépatite B Les Vaccins simples à usage humain

4. Fabrication d’un vaccin

5. Les bactéries Les virus Les cellules eucaryotes: - pour productions virales - pour production par génie génétique Hépatite B : levures ou cellules de Hamster chinois POUR PRODUIRE DES VACCINS DE QUALITE, IL FAUT DISPOSER DE GERMES BIEN CARACTERISES ET DE PROPRIETES CONSTANTES LES ACTEURS

6. LE SYSTEME DES SEMENCES PREVIENT LA DERIVE GENETIQUE

7. SEMENCE : congelée ou lyophilisée INOCULUM : repiquage sur milieux nutritifs (liquides ou gélosés) PRECULTURE :petit fermenteur (quelques dizaines de litres) - phase de croissance CULTURE : fermenteurs de plusieurs centaines ou milliers de litres - phase de croissance - phase d'expression des antigènes LA CULTURE DES BACTERIES

14. Milieux complexes (bactéries fastidieuses) Matières premières contrôlées (analyses, origine) Stérilité, asepsie Maîtrise des paramètres de culture - temps - pureté pH - température - numération - pression - aspect des germes - mousse - métabolites - agitation - aération LA CULTURE DES BACTERIES

15. LA CROISSANCE EXPONENTIELLE

18. - de grands volumes - une très forte aération - une très forte agitation - des milieux concentrés pour augmenter les concentrations bactériennes Dans la culture des bactéries,on recherche :

19. Les virus sont des êtres rudimentaires, parasites obligatoires des cellules. Leur culture implique nécessairement la culture préalable de cellules animales Cellules animales Virus  Culture cellulaire  Infection  Culture virale LA CULTURE DES VIRUS

20. 1) Cultures sur organes Ensemencement d ’œufs embryonnés de poule - cavité amniotique : Vaccin oreillons - cavité allantoïdienne : Vaccin grippe 2) Organes animaux mis en culture (cellules primaires)- dilacération, trypsination des tissus animaux (reins de singes, embryons de poulets) ex. Vaccin rougeole Cellules diploïdes à durée de vie limitée (origine embryonnaire) Cellules MRC5 (vaccin rage) Les cultures de cellules animales

21. 4)Lignées de cellules animales (cellules hétéroploïdes) - cellules immortalisées (vero, MDCK, PERC6) - multiplication sur des surfaces adhérentes - ou multiplication sur billes ou en suspension (avenir) Les lignées de cellules non-tumorigènes ne croissent que sur un support solide, et s'arrêtent de croître au contact les unes des autres ex. : vaccins polio injectable et oral ; vaccin hépatite B ; vaccin rage ; vaccin rubéole …. Les cultures de cellules animales

23. - de grandes surfaces - une faible aération, généralement accompagnée de CO2 - une agitation faible ou nulle - des milieux iso-osmotiques, c'est-à-dire dont l'osmolalité est proche de celle du sang (# 285 mmol/kg) Dans la culture des cellules animales, on recherche :

24. Récipients de culture virale :

31. - Soit: Elimination du milieu par centrifugation aseptique (coqueluche cellulaire, levures pour vaccin Hépatite B) - Soit:Récolte du milieu et sauvegarde ou élimination des cellules par centrifugation ou filtration aseptique (antigènes solubles ou virus excrétés) : vaccin viraux Note : dans ce dernier cas, on peut parfois effectuer plusieurs récoltes et renouvellements du milieu, si les virus ne sont pas lytiques La récolte des cultures

32. - par précipitation à l'aide de sels(sulfate d'ammonium)ou de solvants(éthanol, polyéthylène glycol) - [ex. anatoxines, polyosides] - par ultrafiltrationsur membranes filtrantes minérales ou organiques, à pouvoir de coupure calibré (pouvoir de retenir les grosses molécules) - 10 000, 50 000, 100 000, 300 000 daltons ex. : vaccin polio; rage. La concentration des antigènes

33. BUT :Séparer les antigènes recherchés de l'extrait brut concentré obtenu après récolte. - MOYENS :Procédé effectué par étapes successives, qui s'adressent à des propriétés spéciales de l'antigène, pour le sélectionner parmi la masse des autres composants. La purification

34. Exemple : - sels de calcium, d'ammonium - solvants : éthanol, méthanol polyéthylène glycol Ici, on insolubilise tour à tour les différentes molécules présentes dans le mélange. La précipitation fractionnée

35. Technique Caractère discriminant - échanges d'ions (propriétés électriques des molécules) - hydrophobe (hydrophilie des molécules) - gel d'exclusion (taille des molécules) - affinité (attirance des molécules par un motif : ligand) La chromatographie

37. L'ULTRACENTRIFUGATION Centrifugeuses soumises à des accélérations de plusieurs dizaines de milliers de fois la pesanteur terrestre ; on peut trier les molécules, en les sédimentant : - par taille (ultracentrifugation de vélocité) - par densité (ultracentrifugation isopycnique dans un milieu de densité croissante) La purification - 3

39. Certains antigènes sont inoffensifs - polyosides bactériens - germes atténués (virus rougeoleux, BCG) D'autres sont pathogènes - toxines (diphtérique, tétanique) - germes virulents (B. pertussis, virus rabique) Pour ces derniers, une fois purifiés, il faut inactiver leur pouvoir pathogène, c'est l'inactivation. L'inactivation

40. Par la chaleur (B. pertussis) Par des agents chimiques (formol, Beta-propiolactone, …) L'inactivation doit être totale, et respecter les structures immunogéniques de l'antigène. L'inactivation (suite)

41. SRAS-CoV - INACTIVATION BPL 1/4000

42. Les contrôles de qualité des principes actifs ÉtapesContrôles Qualité matières premières ANALYSES semences ANALYSES cultures ANALYSES récoltes ANALYSES purifications ANALYSES inactivations ANALYSES Les temps de contrôle représentent souvent plus des trois quarts du temps de cycle de la fabrication

44. - Réceptionne les différentes valences antigéniques - Fabrique les valences vaccinales - A l'aide de diluants, de stabilisants et d'adjuvants, formule le vaccin final vrac en un lot homogène qui est soumis aux contrôles d'activité. L'ORDRE DES MELANGES, L'ASEPSIE, LA PRECISION DES MESURES, SONT PRIMORDIAUX POUR OBTENIR UN VACCIN DE QUALITE Le Service des mélanges

47. - Lave et stérilise les contenants - Prépare l'équipement de remplissage - Connecte le produit vrac désiré - Remplit le produit dans les récipients finaux :seringues, ampoules, flacons. L'ASEPSIE DE TOUTES LES OPERATIONS, LA GESTION DES OBJETS DE REPARTITION, LA CHAINE DE FROID, SONT DES FACTEURS CRITIQUES DE LA REPARTITION. Le Service de répartition

49. Certains antigènes, tels les vaccins vivants, sont trop fragiles pour être gardés en dilution liquide, même au froid. On a alors recours à la congélation (B.C.G., vaccin polio oral) ou, plus souvent, à la lyophilisation. La lyophilisation est la dessiccation d'une solution, congelée par évaporation de l'eau directement de l'état solide (glace), à l'état vapeur, sans passer par la phase liquide. Menée au froid et sous vide poussé, elle respecte les structures des molécules et des germes. La lyophilisation