Functionalizarea siliciului cu film de aur pentru imobilizarea fragmenteleor de ADN

1. Functionalizarea siliciului cu film de aur pentru imobilizarea fragmenteleor de ADN Monica Simion, Irina Kleps, Anca Angelescu, Adina Bragaru, Mihaela Miu, Mihai Danila, Marieta Costache1 National Institute for Research and Development in Microtechnologies 1Universitatea Bucuresti,Facultatea de Biologie e-mail: monicas@imt.ro;

2. Echipament PCR classic (termo-amplificator genetic; Eppendorf Mastercycler Model 384); Observatie: costul unui astfel de echipament poate ajunge pina la 9000$ Reprezentare schematica a structurii Structura pe siliciu pentru amplificarea AND-ului Observatie: costurile vor fi de ordinul zecilor de dolari timp de amplificare redus

3. a) b) Rezistor Ti/Pt Camera de reactie Plachete siliciu cu structuri test a)fata cu rezervor b) fata cu rezistor

4. Imagine microscop optic detalii rezistor de Platina Imagine microscop optic Detalii camera de reactie

5. Biochip pentru analiza AD N cu functie de PCR (polimeraze chain reaction) Cerere de Brevet: Procedeu de realizare a unui biochip cu functia de amplificare a unor fragmente specifice de ADN prin reactia polimerazica in lant Autori: Monica Simion, Irina Kleps, Anca Angelescu, Teodora Neghina, Mihaela Miu, Adina Bragaru, Tatiana Oana Nedelcu, Florea Craciunoiu, (IMT-Bucuresti), Eduard Condac (UB, Facultatea de Biologie). MEDALIE DE ARGINT - Eureka 2005 -Buxelles

6. Functionalizarea chimica a reactorului PCR In literatura se cunosc o serie de proceduri chimice pentru legarea covalenta a oligonucleotidelor de substratul solid direct sau prin intermediul unui linker. Tipic folosirea unui suport solid cere prezenta pe suprafata acestuia a unor grupari nucleofile care sa reactioneze cu oligonucleotide care sa contina grupari reactive. Imobilizarea ADN-ului este critica pentru tehnologia chip-urilor.Se cunosc o serie de metode pentru a atasa oligonucleotide, pe substratul de siliciu, in functie de gruparea care se afla la capatul 5’ al acesteia. Daca la capatul 5’ se afla grupari -SH, suprafata poate fi functionalizata cu –OH, -NH2, -COOH sau chiar -SH, iar daca la capatul 5’ se afla -NH2, suprafata poate avea grupari -COOH, >C=O.

7. Experimentari tehnologice pentru functionalizarea cu Au a reactorului PCR • Se propune o metoda noua de functionalizare a suprafetei reactorului care este in curs de brevetare; • Experimetarile au fost facute pe plachete de Si de tip p(100) sau n(100), de rezistivitate 0.01-0.001 cm, cu suprafata foarte rugoasa obtinuta prin corodare chimica in KOH. • Suprafata reactorului din Si a fost acoperita cu strat de aur de grosime 10 nm, obtinut prin evaporare in vid; • Probele au fost tratate termic in atmosfera reducatoare;

8. Imagine obtinuta prin microscopie optica a suprafetei unui reactor PCR corodat in Si si functionalizat cu Au Se observa suprafata puternic rugoasa a Si (100) dupa procesul de corodare anizotropa in solutie de KOH 25 %.

9. Spectru Raze X Au/Si Se observa o texturare a Au(111) pe suprafata de Si rugos a reactorului PCR; prezenta Au(111) nu se observa pe suprafete lustruite de Au/Si.

10. Imagine SIMS pentru sistemul Au/Si inainte de efectuarea tratamentului termic Se observa formarea unei inerfete reactive Au-Si. Se mai observa prezenta oxigenului nativ si a carbonului de contaminare

11. Imagini SEM alestructurilor Au/Si inaintea tratamentului termic

12. Spectru de raze X pentru sistemul Au/Sidupa tratamentul termic Se observa accentuarea texturarii Au(111) dupa tratamentul termic in atmosfera reducatoare

13. Caracterizarea structurii dupa tratamentul termic Imagine obtinuta prin microscopie optica a unui reactor functionalizat cu aur

14. Rezultate imobilizare ADN • Fragment ADN uman D1S-2644 microsatelit amplificat prin reactie de PCR • Oligonucleotida marcata florescent 5’ TET- TGCAACCCACCTGAATGA 3’ (10 pmoli/ml in 10% DMSO) prin incubare la 80oC timp de 2 h • Hybridizare a probei Imobilizare oligonucleotida fluorescenta pe Au/Si (A-20X, B- 40x)

15. Rezultate imobilizare ADN Hibridizare ADN pe Au/Si (A-20X, B- 40x)

16. Analizele XRD ale filmelor de aur tratate termic au scos in evidenta o texturare a stratului de aur. Factorul de orientare se accentuiaza după tratamentul la 500oC (textură 111). Pentru probele Au/Si care au suferit tratament la 900oC se observa o crestere in intensitate a valorii maximului pentru textura Au(111) si disparitia celor de tip Au(200) si Au(311). Imobilizarea probelor de ADN pe suprafata reactorului Au/Si este foarte uniforma atit inainte cit si dupa hibridizare, comparativ cu probe functionalizate chimic cu polilizina sau cu polipirol. Se mentioneaza ca mecanismul de atasare a fragmentelor ADN pe suprafata Au este diferit de cel prin auto-asamblare, prin intermediul unor grupari tiol (-SH). In cazul de fata oligonucleotidele modificate chimic cu grupari –NH2, s-au atasat covalent de suprafata Au/Si tratata termic. Se presupune ca acesta suprafata este functionalizata cu grupari >C=O (posibil –COOH) rezultate din activarea carbonului de contaminare prin tratamentul termic reducator si oxidare ulterioara. Concluzii

17. “Micro fluidic Biochip for Bio-medical Application”, Monica Simion, Anca Angelescu, Irina Kleps, Mihaela Miu, Marioara Avram, Florea Craciunoiu, Teodora Ignat, Adina Bragaru, ICM 2004, Tunis, Tunisia, 2004 “Electro-Thermal Simulation and Design of Silicon Based Bioanalytical Micro- devices”, Monica SIMION, Irina KLEPS, Oana Tatiana NEDELCU, Anca ANGELESCU, Mihaela MIU, ICIT2004, Hammamet, Tunisia, 2004 “Activities of Cellular and molecular Pharmacology centre concerning biomedical applications of nanotechnlogy”, Mihaela Albulescu – ICCF Bucuresti - „6th Advanced Course In Cell-material Interactions at Molecular Level”, Porto, Portugal, June 20-24, 2005; “Silicon microsystems for controlled drug delivery”,Mihaela Miu, Anca Angelescu, Irina Kleps, Monica Simion, Adina Bragaru, Teodora Neghina – IMT Bucuresti -, 3rd World Conference on Drug Absorption, Transport and Delivery Clinical Significance and Regulatory Impact, Barcelona, 18-20.04.2005 Nanoporous silicon matrix used as biomaterial, Monica Simion, Irina Kleps, Teodora Negina, Anca Angelescu,Mihaela Miu, Adina Bragaru, Mihai Danila, Eduard Condac, Lorand Lavu, Marieta Costache, ISMANAM05, France, 2005 LUCRARI