Laboratório de Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos

1. Área de concentração: Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos Laboratório de Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos Defesa de dissertação de mestrado Influência de Peptonas Vegetais no Cultivo de Streptococcuszooepidemicus para a Produção de Ácido Hialurônico Aluno: Leandro Junqueira Benedini Orientadora: Profa Dra. Maria Helena Andrade Santana

2. Sumário • Introdução • Artigo 1: Influência de Peptonas Vegetais Sobre a Produção Microbiana e Pureza do Ácido Hialurônico. • Artigo 2: Efeitos da Peptona de Soja sobre Preparação de Placas Petri e Produção de Ácido Hialurônico.

3. Ácido Hialurônico Propriedades Físico-Químicas Estrutura altamente hidratada Ácidos D-Glicurônico e N-acetilglicosamina Propriedades viscoelásticas - Face hidrofóbica H Moléculas pequenas difundem no domínio aquoso Moléculasgrandessãoexcluídas

4. Ácido Hialurônico Fontes de obtenção (Adam e Ghosh, 2001; Iqbalet al., 1997.) (Koganet al., 2007e Pires, 2009)

5. Ácido Hialurônico Aplicações • Oftalmologia; • Ortopedia; • Proteses; • Cura de feridas; • Dermatologia. • Liberação controlada de fármacos Azari et. Al (2011),

6. Ácido Hialurônico • Complexo processo de purificação • Riscos de infecções virais • Riscos de reações alérgicas Os recursos animais e microbianos Recursos animais Produção microbiana Início em 1980 Microorganismos do gênero Streptococcus Mesma estrutura química Massa molar: 2,4-3,4 × 106 Da Melhor qualidade do produto

7. Streptococcus zooepidemicus • Microorganismos gram-positivos e anaeróbicos • Bactérias láticas nutricionalmente fastidiosas • Requerem meio de cultivo rico para crescimento • Produção de AH • AH sintases • Cápsula de proteção • Ocultação de sistemas imunológicos Chong et. al (2005)

8. Caminhosmetabólicos de Streptococcus zooepidemicus: De glicose a AH Biopolímero Extracelular (a) (b) (a) Metabolismos homolático e (b) misto HAS,hyaluronate synthase; NOX, NADH oxidase; LDH, lactate dehydrogenase; PFL,pyruvate formate lyase; PDH, pyruvate dehydrogenase; ADH, alcohol dehydrogenase; AK, acetate kinase

9. Condições operacionais • pH • Entre 6,5 e 7,5 (Akasaka, 1998) • Choques de pH: Maior produção de células e AH (Pires, 2009) • Aeração • Maior crescimento (Chong e Nielsen, 2003) • AH com maior massa molar (Akasaka et al., 1989) • Maior concentração de AH (Chong & Nielsen, 2003) • c • Agitação • Relação com transferência de oxigênio • Tensãomecânica: Danos à cadeiapolimérica • c

10. Fontes de energia • Fontes de carbono • Produção dependente de AH (Pires, 2009) • Maior produção de AH (1,21 g.L-1) em cultivo com 25 g.L-1 glicose (Pires, 2009) • Fontes de nitrogênio • Hidrolisados de caseína, aminoácidos, peptonas e extrato de leveduras (Batistote, 2006 e Pires, 2009) • Responsáveis por crescimento microbiano e produção de metabólitos de interesse

11. Preparação de inóculos • Streptococcus equi subsp. zooepidemicusATCC 39920,. II I Remoção de células Adição de células Inóculo líquido, 12 h III Componentes das placas Petri: BHI (Brain Heart Infusion) Sangue de carneiro

12. Fermentações em batelada • Fontes de carbono • Fontes de nitrogênio • Sem controle de pH • Sem alimentação de oxigênio • Menor turbulência • Fontes de carbono • Fontes de nitrogênio • Controle de pH • Alimentação de oxigênio • Maior turbulência

13. Recuperação de Ácido Hialurônico

14. As impurezas no AH recuperado • Extrato de leveduras (EL) • Fonte microbiana • Grande quantidade de aminoácidos essenciais • Meio com muitas proteínas • Peptonas vegetais (PVs) • Fonte vegetal • Quantidade relevante de aminoácidos essenciais • Muitos peptídeos Table 1 – Total and free amino acids contents in soy (SP) wheat (WP) and potato (PP) peptones. Data from the manufacturer Organotechnie (France). Pg 34. Fonte: Organotechnie

15. Objetivos: • Substituição de extrat0 de leveduras por PVs em fermentações • Produção de AH • Proteínas ou peptídeos associados • Substitução de BHI e sangue de carneiro por PS em placas Petri. • Adaptação celular • Produção de AH

16. Artigo 1 Influência de PeptonasVegetaisSobre a ProduçãoMicrobiana e Pureza do ÁcidoHialurônico.

17. Objetivos • Substituição de extrato de leveduras por peptonas vegetais • Peptona de soja (SP) • Peptona de batata (PP) • Peptona de trigo (WP) • Mistura de PVs (MPV) • Quantificação de proteínas ou peptídeos retidos em AH produzido • Estudo cinético de fermentações.

18. Procedimento experimental • Quantificação de nitrogênio e glicose nas peptonas: • Método de Kjeldahl • Kit de determinação de glicose Laborlab. Table 2 - Total nitrogen (TN), total protein and peptides (TPP) and glucose (G) in the vegetable peptones and in the yeast extract in the fermentation media at the starting of the fermentations

20. Métodos e Análises • Quantificação de proteínasoupetídeos • Método de Lowry • Ácidosorgânicos • HPLC • Massa molar • HPLC • Crescimento celular • Método gravimétrico • Purificação de AH • Precipitação com etanol • Ressuspensão em NaCl • Quantificação de AH • Método do carbazol modificado

21. Table 3 - Performance of the vegetable peptones and yeast extract on the production of HA from Streptococcus zooepidemicus (ATCC 39920) during 24h fermentation and its purity after three precipitations with ethanol. HA – Hyaluronic acid; YP/X - HA production per cell growth; YP/S - HA production per glucose consumption; YX/S - Cell growth per glucose consumption; YLactate/S - Lactate production per glucose consumption; YAcetate/S - Acetate production per glucose consumption; FE – Free essential amino acids; TE – Total essential amino acids; TPP - Total proteins and peptides; MW – Average molecular weight.

22. Figure 1 – Kinetic profiles of (a) cell growth (b) nitrogen (c) glucose (d) HA concentration (e) HA molar weight and (f) lactate concentration along cultivations of Streptococcus zooepidemicus in SP (♦) and WP (■) media.

23. Figure 1 – Kinetic profiles of (a) cell growth (b) nitrogen (c) glucose (d) HA concentration (e) HA molar weight and (f) lactate concentration along cultivations of Streptococcus zooepidemicus in SP (♦) and WP (■) media.

24. Conclusões • SP é a peptona vegetal mais promissora • Fermentação com SP: 0,28 g.L-1 de AH • Fermentação com YE: 0,21 g.L-1 de AH • Fermentações com SP produzem AH com menor quantidade de proteínas e peptídeos (TPP) e com mesma massa molar • Fermentação com SP: 1,4 g.g-1 • Fermentação com YE: 4,1 g.g-1 • Tempo recomendável para fermentação: 5 horas.

25. Artigo 2 Efeitos da Peptona de SojasobrePreparação de Placas Petri e Produção de ÁcidoHialurônico.

26. Objetivos • Utilização de SP em placas Petri • Definição de composição mais apropriada. • Validação com fermentações

27. Procedimento experimental • Preparação de placas Petri • BHI e sangue de carneiro • SP e sangue de carneiro • SP • Meios de cultivo • SP e glicose • Relaçãoglicose/N = 7.8

29. Métodos e Análises • Ácidosorgânicos • HPLC • Massa molar • HPLC • Crescimento celular • Método gravimétrico • Purificação de AH • Precipitação com etanol • Ressuspensão em NaCl • Quantificação de AH • Método do carbazol modificado

30. Table 1 - Performance of the fermentations with substitutions of the animal nutrient sources, Brain Heart Infusion and sheep blood, by soy protein in the first seed culture medium Streptococuszooepidemicus(ATCC 39920) in Petri plates.

31. Conclusões • A substituição de sangue de carneiro e BHI por SP em inóculos sólidos levou a produção similar de AH • Sem substituição: 0,29 g.L-1 • Com substituição: 0,30 g.L-1 • A utilização de SP em inóculos sólidos levou a produção de AH com massas molares semelhantes

32. Sugestões • Planejamento experimental para estimativa da ótima relação C6H12O6/N. • Planejamento experimental em reatores, para estimar a ótima rotação e vazão de alimentação de oxigênio do fermentador. • Utilização de peptona de soja em fermentações com choque ácido. • Desenvolvimento de novos métodos para purificação do AH.

33. Bibliografia • ARMSTRONG, D.C. The molecular weight properties of hyaluronic acid producedStreptococcus zooepidemicus. Queensland: University of Queensland, 1997. (PhD. Thesis). • BLANK, L.M., MCLAUGHLIN, R.L., NIELSEN, L.K. Stable production of hyaluronic acid in Streptococcus zooepidemicus chemostats operated at high dilution rate. Biotechnol. Bioeng., v.90 • CHONG, B.F.; BLANK, L.M.; MCLAUGHLIN, R.; NIELSEN, L.K. Microbial hyaluronic acid production. Appl. Microbiol. Biotechnol., v.66, n.4, p.341-351, 2005. • HELDIN, P. (2003) Importance of hyaluronan biosynthesis and degradation in cell differentiation and tumor formation. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. Brasil, pp. 967-973. • IZAWA, N.; HANAMIZU, T.; SONE, T.; CHIBA, K. (2010) Effects of fermentation conditions and soybean peptide supplementation on hyaluronic acid production by Streptococcus thermophilus strain YIT 2084 in milk. Journal of Bioscience and Bioengineering. Pp. 356-360. • JOHNS, M.R.; GOH, L.T.; OEGGERLI, A. Effect of pH, agitation and aeration on hyaluronic acid production by Streptococcus zooepidemicus. Biotechnol. Lett., v.16, n.5, p.507-512, 1994. • PIRES, A., MACEDO, A.C., EGUCHI, S.Y., SANTANA, M.H.A. Microbial production of hyaluronic acid from agricultural resource derivatives.Bioresource Technology 101, 6506-6509, 2010. • PIRES, A., SANTANA, M.H.A. Metabolic Effects of the Initial Glucose Concentration on Microbial Production of Hyaluronic Acid. Appl Biochem Biotechnol (2010) 162, 1751–1761, 2010. • ZISU, B.; SHAH, N. (2003) Effects of PH, temperature, suplementation with whey protein concentrate, and adjunct cultures on the production of Exopolysacharides by Streptococcus thermophylus 1275. Journal of Dairy Science. Pp 3405-3415.