Alessia Stell Maggi Lab 13.01.2011

1. Alessia Stell • Maggi Lab • 13.01.2011 Le proteine terapeutiche

2. Le proteine Più di 40.000 e moltissime funzioni OPPORTUNITA’ TERAPEUTICA

3. Cosa sono le proteine terapeutiche Proteine che sono state estratte da cellule umane o ingegnerizzate in laboratorio per essere utilizzate come farmaci (ricombinanti o non ricombinanti) Rimpiazzare la mancanza patologica di una proteina(enzimi, fattori del sangue) Rafforzare il sistema immunitario, contro cellule tumorali o infezioni(anticorpi monoclonali) Più di 250 in commercio, più di 400 in trial clinico

4. Quali sono vantaggi/svantaggi? VANTAGGI SVANTAGGI • Attività mirata e altamente specifica • Limitati effetti collaterali • Generalmente ben tollerate • Possono sopperire ad un difetto genetico • Veloce sviluppo clinico e approvazione FDA • Vantaggio finanziario: brevettabilità • Metodologie di produzione • Contaminanti nella purificazione • VIE DI SOMMINISTRAZIONE E FARMACOCINETICA

5. Sviluppo delle proteine terapeutiche • Proteine di I generazione identiche alle proteine endogene umane • Proteine di II generazione modificate al fine di: • Migliorarne le caratteristiche farmacocinetica (diminuire la biodegradabilità, aumentare la penetrazione cellulare, ecc) • Generare prodotti inattivi con funzioni diverse da quelle originarie • Generare dei prodotti più stabili facilitandone la conservazione • Biosimilari

6. Produzione di proteine terapeutiche Proteine poco complesse • BATTERI • Ancora il più usato • Ottimizzazione • Problemi: recovery delle proteine  secretory signal peptide – mutazione del punto isoelettrico • Poche modificazioni post-traduzionali • PIANTE • Utilizzo in lenta crescita • Codice regolatorio per espressione • No modificazioni post-traduzionali • . Grandi volumi possibili Proteine complesse • CELLULE ANIMALI • Alti livelli di espressione e modificazioni • Costi elevatissimi per set-up e tempi lunghi per FDA approval • ANIMALI TRANSGENICI • Alti livelli di produzione • Espressione di proteine anche molto complesse • Costi bassi • Riproducibilità della produzione • Limite: approvazione regolatoria

7. Classificazione funzionale delle proteine terapeutiche Gruppo I Proteine con attività enzimatica o regolatoria Proteine con attività di targeting specifico Gruppo II Gruppo III Vaccini proteici Proteine diagnostiche Gruppo IV

8. Gruppo I Proteine con attività enzimatica o regolatoria

9. Rimpiazzare una proteina carente o non funzionale 1 Classiche proteine terapeutiche Utilizzate nel trattamento di malattie metaboliche o malattie genetiche che portano a carenza di una proteina

10. CLASSICO ESEMPIO: insulina nel trattamento del diabete Diabete: malattia caratterizzata da un alto e anormale tasso di zuccheri nel sangue, causato dalla carenza di insulina o resistenza alla sua azione Insulina: prima proteina terapeutica ricombinante ad entrare in commercio, nel 1982

11. Fattori di Coagulazione: altre proteine terapeutiche molto diffuse Emofilia: malattia genetica ereditaria che causa problemi nell’aggregazione piastrinica e nei processi di coagulazione Fattori di coagulazione: I fattori VIII e IX della coagulazione possono essere ripristinati negli emofilici

12. Nuovi trattamenti per malattie genetiche ereditarie Malattie come Gaucher, Fibrosi cistica, mucopolisaccaridosi, malattia di Fabry e altre malattie metaboliche genetiche Trattamento con enzimi e proteine che vanno a sopperire la carenza (es. enzimi pancreatici nella fibrosi cistica, beta-glucocerebrosidasi nella malattia di Gaucher)

13. Vantaggi delle tecniche del DNA ricombinante nella produzione di proteine terapeutiche di classe I Prima del DNA ricombinante Dopo il DNA ricombinante Insulina Dal 1982, prima proteina ricombinante commecializzata. Produzione efficiente e poco costosa. Dal 1922, purificata da pancreas bovini e porcini, e somministrata come iniezione in pazienti con diabete Problemi: - disponibilità di pancreas - costo della purificazione - reazioni immunologiche Beta-glucocere-brosidasi Possibili modificazioni (es, sostituz di un aa, che migliora le performance) Problemi: - disponibilità di placenta (50.000 placente/anno/paziente) Vantaggi connessi a minor costi, maggiore produzione, eliminazione rischio di malattie trasmissibili associate con la purificazione Inizialmente purificata dalla placenta umana

14. Rafforzare un pathway già esistente 2 Utilizzate per stimolare, aumentare, migliorare o allungare nel tempo un particolare meccanismo, anche se il meccanismo d’azione dettagliato non è noto

15. tPA (tissue plasminogen activator) ricombinante: L’infarto del miocardio: - Più comune causa di morte negli USA - dovuto ad occlusione di arterie coronarie causata dalla formazione di un trombo di una placca aterosclerotica. - Studi clinici hanno dimostrato che la lisi dei trombi con attivatori del plasminogeno diminuisce la mortalita’. Il tPA va ad ad agire nel processo di coagulazione

16. Il tPA agisce aumentando il processo fibrinolitico tPA prodotto dalle cellule endoteliali Plasmina (enzima fibrinolitico) Plasminogeno (proenzima)

18. Proteine terapeutiche di questo gruppo possono essere impiegate nella IVF IVF (in vitro fertilization): fertilizzazione della cellula uovo con lo spermatozoo in vitro. FSH (follicle-stimulating hormone): stimolo per oociti HCG (human chorionic gonadotropin): per promuovere la rottura del follicolo

19. Eritropoietina ricombinante Anemia e sindrome mieloplastica: presenti spesso nel caso di trattamenti chemoterapici che colpiscono le cellule del midollo osseo Eritropoietina: ormone secreto dai reni che stimola la produzione di eritrociti da parte del midollo osseo

20. Fornire una nuova funzione o attività 3 Proteine non umane presenti in natura sono utilizzate come trattamenti terapeutici per le patologie umane  uso razionale

21. Esempi dell’uso terapeutico di proteine esogene Papaina: proteina estratta dalla papaya usata per accelerare la riparazione delle ferite e la guarigione delle ustioni Irudina: proteina prodotte dalle ghiandole salivari delle sanguisughe (Hirudo medicinalis), ed è un potente inibitore della trombina (funzione anticoagulante)

22. Gruppo II Proteine con attività di targeting specifico

23. Interferire con una specifica molecola o meccanismo 1 Sfruttano la fine specificità di binding degli ANTICORPI MONOCLONALI; usate nel trattamento di patologie infiammatorie o tumori

24. Struttura degli anticorpi Parte di riconoscimento dell’antigene; nelle IMMUNOADESINE esso è sostituito con siti di binding a recettori di membrana Fc: fragment crystallizzable Riconosciuto dalle cellule del sistema immunitario  “tagga” le cellule che devono essere distrutte o eliminate

25. Tipi di anticorpi Murino Chimerico Umanizzato Umano Alta immunogenicità; Interazioni deboli con le proteine del complemento  poco efficiente; Bassa emivita. Dominio variabile murino e dominio costante umano; Riduce immunogenicità e aumenta emivita Con regione ipervariabile murina e restante umana (95%). A volte però meno efficaci Completamente umani, prodotto attraverso phage display o topi transgenici

26. Nomenclatura degli anticorpi Es. TRAS-TU-ZU-MAB

27. Proteine di classe II che hanno TNFalfa come bersaglio – terapia immunogenica TNF-a: citochina implicata nei processi infiammatori sistemici; stimola le reazioni di fase acuta. La sua deregolazione è implicata in diverse patologie, inclusi alcuni tumori Immunoadesine Anticorpi monoclonali ETANERCEPT: Proteina di fusione tra TNFalpha receptor e regione Fc dell’IgG Lega l’eccesso di TNFa nel plasma, marcandolo per essere eliminato dal sistema immunitario. Terapia per artrite e psoriasi INFLIXIMAB - ADALIMUMAB: Anticorpi monoclonali contro TNFa Terapia per artrite reumatoide, Morbo di Crohn.

28. Proteine terapeutiche di classe II nella terapia oncologica Due meccanismi Aumento dell’immunogenicità Attivazione di pathways intracellulari RITUXIMAB: Lega la proteina transmembrana CD20 espressa sulle B-cells Il legame stimola la risposta immunitaria. Più del 90% delle B-cell dei linfomi non-Hodgkin’s esprime in maniera specifica CD20 terapia specifica. CETUXIMAB: Lega EGF receptor e stimola la risposta immuno-mediata. EGFR è espresso sulle cellule di alcuni tipi di tumori, come il carcinoma del colon-retto e tumore del collo TRASTUZUMAB: Lega il recettore HER2 sulle cellule tumorali della mammella. Sebbene contenga la Fc region che stimola la risposta immunitaria, la sua azione sembra indurre pathways di segnalazione intracellulare che portano al blocco della cdrescita e all’inibizione dell’angiogenesi RITUXIMAB MODIFICATO: Modificazioni nella Fc  stimolo dell’apoptosi

29. Proteine terapeutiche di classe II nella terapia di altre condizioni patologiche Nei trapianti d’organo: per ridurre i fenomeni di rigetto. Es. BASILIXIMAB, DACLIZUMAB: inibiscono l’attivazione dei linfociti IL-2 mediata poiché legano IL2 receptor Nelle infezioni da HIV: Es. ENFUVRITIDE: immunoadesina costituita da un peptide di 36 aa che inibisce l’entrata di HIV nella cellula ospite + riconoscimento per gp120 (proteina dell’envelope di HIV) Nel trattamento di asma irresponsiva a normali trattamenti: Es. OMALIZUMAB: lega il recettore si mastociti e basofili nei polmoni, riducendo il rilascio di mediatori infiammatori

30. Delivery di altri composti o proteine al sito target 2 Sfruttano la fine specificità di binding degli ANTICORPI MONOCLONALI per fare delivery di altri composto, sostanze, medicinali. Area in grande sviluppo

31. Tipologie di anticorpi di delivery Cellula tumorale

32. Coniugati anticorpo-farmaci chemioterapici Agenti citotossici e chemioterapici Chemiotereapia tradizionale Associazione con mABs Non sono tumore-specifici, e si basano solo sul concetto che le cellule a più alta proliferazione (quelle tumorali, ma non solo) sono più sensibili alla citotossicità. EFFETTI COLLATERALI  dati a dosi sub-optimali L’associazione con anticorpi che targettizzano le cellule tumorali  il farmaco è internalizzato solo nelle cellule tumorali attraverso internalizzazione recettore-mediata. Unico approvato: GEMTUZUMAB: lega le proteine CD33 espresse sulle cellule tumorali e rilascia OZOGAMICINA, un composto citotossico

33. Coniugati proteina-tossine e radioimmunoconiugati Tossine coniugate a proteine Radioimmunoconiugati Le tossine sono generalmente enzimi che esercitano la loro funzione citotossica all’interno della cellula; in molti casi anche una sola molecola trasportata nel giusto compartimento cellulare è un grado di uccidere la cellula. Possono essere coniugati ad anticorpi o ad altre proteine Es. DENILEUKIN DIFTITOX (unico approvato FDA): frammenti di tossina difterica fusi con Interleuchina-2, per trattamento del linfoma cutaneo refrattario Le tossine sono generalmente enzimi che esercitano la loro funzione citotossica all’interno della cellula; in molti casi anche una sola molecola trasportata nel giusto compartimento cellulare è un grado di uccidere la cellula. Possono essere coniugati ad anticorpi o ad altre proteine Es. DENILEUKIN DIFTITOX (unico approvato FDA): frammenti di tossina difterica fusi con Interleuchina-2, per trattamento del linfoma cutaneo refrattario

34. Gruppo III Vaccini

35. Protezione contro agenti esterni patogeni 1 Sfruttano le caratteristiche immunogeniche delle proteine per l’applicazione come profilassi nella protezione di agenti esterni. Area in grande sviluppo, per ora molto limitata

36. Esempi di vaccini proteici Vaccino per Epatite B: creato producendo con ta tecnica del DNA ricombinante gli antigeni di superficie del virus, delle proteine non infettive che scatenano la reazione immunitaria. Vaccino per HPV (human papilloma virus): recentemente approvato, sfrutta proteine del capside per dare protezione al virus, e anche contro il tumore alla cervice ad esso correlato

37. Trattamento di disordini autoimmuni 2 Protezione contro un sistema immunitario iper-reattivo che riconosce come agenti estranei proteine endogene

38. Vaccini contro tumori 3 Ancora no approvati da parte dell’FDA, ma alcuni in sperimentazione clinica. Risente molto delle nuove scoperte della medicina di base, che fornisce target per la vaccinazione

39. Vaccino contro linfoma non-Hodgkin’s Nei linfomi non-Hodgkin’s si ha una proliferazione maligna delle cellule B, che mostrano tutte un unico anticorpo specifico sulla loro superficie. La regione idiopatica può quindi essere individuata e clonata, ed espressa in piante di tabacco con la tecnica del DNA ricombinante, per ottenere un antigene tumore-specifico utilizzabile per la vaccinazione del paziente. 6-8 settimane per ottenere il vaccino dalla biopsia.

40. Problematiche connesse allo sviluppo di proteine terapeutiche

41. Perché le proteine sono particolari rispetto a composti di natura chimica? • Ordini di grandezza più grandi rispetto a farmaci tradizionali • Strutture secondarie e terziarie  suscettibili a degradazione fisica e chimica • Immunogeniche

42. Problemi di solubilità e stabilità • Grosse molecole con proprietà idrofiliche e idrofobiche • Suscettibili a proteasi e a meccanismi di clearance • AGGIUNTA DI POLIMERI: • Es. PEG (Polyethylene glycol) • low molecular weight • solubile in acqua • polimero non ionico • coniugato in multiple copie • Prolunga la circolazione di proteine terapeutiche o ne altera le proprietà (es. delivery ai tumori)

43. Problemi di immunogenicità • Tutte le proteine esogene (umane e non umane) sono riconosciute dal sistema immunitario come “straniere” e scatenano la risposta immunitaria • Questa risposta immunitaria può alterare le proprietà della proteina terapeutica o essere dannosa per il paziente Enzimi e proteine del Gruppo I: possono scatenare reazioni immunitarie Anticorpi: soprattutto quelli murini, ma anche quelli umani

44. Problemi per trovare la via di somministrazione adatta VIA PARENTERALE: Rappresenta la via d’elezione VIA ORALE: Ad oggi praticamente non utilizzabile, ma desiderabile VIA NASALE, POLMONARE, TRANSDERMICA: Vie alternative non invasive percorribili

45. Limiti della via orale ELEVATA DEGRADAZIONE Endopeptidasi presenti a livello intestinale (pepsina, tripsina, chimotripsina, elastasi) Esopeptidasi (carbossipeptidasi A e B) SCARSO ASSORBIMENTO Molecole di grande dimensioni Assenza di meccanismi di trasporto attivo Struttura ciclica e proprietà lipofiliche

46. Via Parenterale La scelta della via endovenosa,intramuscolare, sottocutanea e intraperitoneale dipende dall’emivita della proteina stessa e dalla concentrazione ematica necessaria per ottenere l’effetto farmacologico Es: l’emivita del TPA è di pochi minuti, mentre quella di un anticorpo monoclonale è di alcuni giorni si possono operare modificazioni nella proteina (mutagenesi) Per aumentare l’emivita si può passare dalla somministrazione per via i.v. a quella i.m. o s.c. tenendo conto che Dopo iniezione s.c. il farmaco può entrare nei capillari linfatici e non utilizzare il torrente circolatorio dando una differente biodisponibilità

47. Vie alternative Per la via nasale solo 3 proteine terapeutiche somministrate Per la via polmonare, aerosol di insulina

49. Referenze • Leader B, Baca QJ, Golan DE. Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nat Rev Drug Discov. 2008 Jan;7(1):21-39. • Brown LR. Commercial challenges of protein drug delivery. Expert Opin Drug Deliv. 2005 Jan;2(1):29-42 • Schrama D, Reisfeld RA, Becker JC. Antibody targeted drugs as cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2006 Feb;5(2):147-59.