А.В. Иванов РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН А.Б. Соловьева ИХФ им. Н.Н.Семенова РАН Н.Г. Хлебцов ИБФ

1. Новые лекарственные формы для люминесцентной диагностики и фотодинамической терапии на основе наноразмерных композитов порфириновых фотосенсибилизаторов с амфифильными полимерами и наночастицами. А.В.Иванов РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН А.Б. СоловьеваИХФ им. Н.Н.Семенова РАН Н.Г. ХлебцовИБФРМ РАН И.П. ШиловИРЭ им. В.А.Котельникова РАН

2. РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН д.ф.-м.н. Иванов А.В., к.м.н. Сухин Г.М., к.б.н. Кузьмина З.В., Полянская Н.И. ИХФ им. Н.Н.Семенова РАН д.х.н. Соловьева А.Б., д.ф.-м.н.Тимашев С.Ф., к.х.н.Глаголев Н.Н., к.х.н.Аксенова Н.А., к.ф.-м.н. Тимашев П.С, к.х.н. Тимофеева В.А. ФГУ «ГНЦ лазерной медицины ФМБА» д.м.н. Толстых П.И., д.м.н. Шин Ф.Е. МГУ им. М.В.Ломоносова д.х.н. Мелик-Нубаров Н.С., Жиентаев Т.М. ИРЭ им. В.А.Котельникова РАН, Фрязино к.т.н.Шилов И.П., к.х.н. Румянцева В.Д., д.т.н. Пожар Э.В., к.ф.-м.н. Маркушев В.М. , Щамхалов К.С. ИБФРМ РАН, Саратов д.ф.-м.н. Б. Н. Хлебцов, к.б.н. Е. В. Панфилова, к.б.н. В. А. Ханадеев, д.б.н.С.А.Староверов СГУ им Н.Г.Чернышевского, Саратов д.ф.-м.н. Н.Г.Хлебцов, д.б.н. Г. С. Терентюк, А. В. Маркин

3. Одна из основных проблем ФДТ – повышение ее эффективности при снижении побочных токсических проявлений. • Частичное решение этой проблемы может быть достигнуто созданием новых фотодинамических препаратов, однако известно, что на это требуется значительное время 5-10 лет и серьезное долговременное финансирование. • Разработка новых более эффективных лекарственных форм уже созданных и получивших разрешение Фармакологического Комитета на применение препаратов. Это наиболее оптимальный, быстрый и окупаемый путь, поскольку в основе новых лекарственных форм заложены уже известные и хорошо себя зарекомендовавшие в лечебной практике препараты.

4. Ранее было показано, что комплексообразование амфифильных полимеров с порфириновыми фотосенсибилизаторами повышает эффективность воздействия ПФС на опухолевые клетки и опухоли поверхностной локализации у крыс в 10 - 30 раз ( патент РФ 2314806). Было также показано, что использование противоопухолевых антибиотиков (доксорубицин, винкристин) совместно с сополимерами этиленоксида и пропиленоксида (плюроников) способствует накоплению антибиотиков в опухолевых клетках. Этот эффект особенно выражен для опухолей с множественной устойчивостью к действию лекарств.

5. I. Фотодинамическая терапия I. Фотосенсибилизаторы: Димегин, фотодитазин – (препарат, применяемый в клинике) Динатриевая соль 2,7,12,18-тетраметил-3,8-ди(1-метоксиэтил)-13,17-ди(2-оксикарбонил этил) порфирина N-метил-ди-D-глюкаминовая соль хлорина е6 Фотодитазин, ФД Димегин, ДМ

6. 2. Полимеры Этиленоксид 1.Плюроник пропиленоксид 2. Поливиниловый спирт —СН2 —СН— ОН 3.1. Карбоксиметилцеллюлоза 3.2. Хитозан n 3. Полисахариды:

8. Состав и физико-химические характеристики мицелл плюроников. ,

9. Механизм взаимодействия плюроников с ПФС Рост фотокаталитической активности порфиринов в присутствии плюроников может быть связан как с эффектом мицеллярного катализа при концентрировании катализатора и субстрата в одной мицелле. Кроме того, солюбилизация может вызывать уменьшение размеров молекулярных агрегатов, которые некоторые порфирины образуют в водной среде. При агрегации активность порфиринов уменьшается. -димегин - фотодитазин - триптофан Вследствие разной гидрофобности димегин и фотодитазин могут локализоваться в разных областях мицелл плюроника.

10. Размеры мицелл плюроника F127 (а), и его комплексов с ФС (б). При увеличении концентрации плюроника до 10-3моль/л средний размер мицелл не меняется. Размер агрегатов фотодитазина <10нм. Присутствие фотодитазина в воде не меняет размер мицелл плюроника, составляющих 10-15 нм. Рост активности агрегированного в воде димегина, очевидно, вызван в основном дезагрегацией. В случае ФД, не образующего заметных агрегатов, и локализованного так же, как и триптофан, в гидрофильной «опушке» плюроников, влияние полимера, вероятно, связано с локальным концентрированием субстрата и катализатора в объеме мицелл.

11. ВЛИЯНИЕ ПОЛИМЕРОВНА НАКОПЛЕНИЕ ФОТОДИТАЗИНА В КЛЕТКАХ (а) (б) - в отсутствие полимеров - в присутствии 0,1% Р85 (а) и ПВС (б) • Полимеры не влияют на количество фотодитазина, проникшего в клетки

12. ВЛИЯНИЕ МИЦЕЛЛ ПЛЮРОНИКА F127 НА РАЗМЕР ПОР МОДЕЛЬНОЙ ЛИПИДНОЙ МЕМБРАНЫ Гидрофильные этиленоксидные фрагменты Схематичное изображение липидной мембраны со «встроенной» молекулой плюроника Гидрофобный пропиленоксидный блок Плюроники не влияют на размер пор липидных мембран, возникающих под действием 1О2(по данным кинетики «вытекания» карбоксифлуресцеина). Однако, они стабилизируют возникающие в мембране дефекты и блокируют пути их репарации.

13. . Влияние карбоксиметилцеллюлозы на фотоцитотоксичность фотодитазина

14. ВлияниеПВС на фотоцитотоксичность фотодитазина

15. В присутствии амфифильных полимеров клетки гибнут в основном по механизму некроза

16. Обнаружено повышение фотодинамического эффекта препаратов при использовании их в комплексе с полимерными носителями на 1,5-2 порядка • Совокупность проведенных экспериментов показывает, что скорее всего эффект амфифильных полимеров в ФДТ связан с дезагрегацией ФС и со стабилизацией дефектов в мембране, вызванных воздействием синглетного кислорода. • Обнаруженный эффект, по-видимому, является общим свойством для различных фотодинамических агентов в комплексах с рядом амфифильных полимеров.

17. Испытания на животных: Использовали мышей двух видов (мыши линии BALB/c, мыши-гибриды F1(CBAxС57Bl/6), которым прививали карциному легких Льюис и неимбредно размножаемые мыши с генотипом Swiss, (прививали асцитную карциному Эрлиха) и крыс линии Вистар (прививали опухоль М1). Общее количество использованных животных составило 1230 мышей трех линий и 110 крыс линии Вистар. Использовали гель ПВС, содержащий 1% димегина. Эффективность ФД-воздействия определялась по динамике роста опухоли (для сόлидных вариантов роста 3-х типов опухолей), числу метастазов в легких (для опухоли КЛЛ), а также клоногенной выживаемости клеток КЛЛ после переноса их в диффузионную камеру. • Использование геля амфифильного полимера, содержащего димегин,не только повышает эффективность ПФС ~ в 10 раз, но и ослабляет интенсивность метастазирования опухолевых клеток в легкие.

18. Показано, что комплексообразование амфифильных полимеров с порфириновыми фотосенсибилизаторами повышает эффективность воздействия ПФС на опухолевые клетки и опухоли поверхностной локализации у животных в 10 - 30 раз ( патент РФ 2314806). Использование комплексов амфифильный полимер-фотодитазин наряду с повышением эффективности ФД-воздействия позволяет в 10-30 раз снизить концентрацию фотосенсибилизатора, а значит и терапевтическую дозу препарата, что ведет к заметному снижению нежелательных побочных токсических явлений

19. Ожоги и раны являются одними из наиболее широко распространенных видов травматических поражений. Увеличение в последние годы  опасности террористических актов и возникновения стихийных бедствий повышает актуальность проблемы оперативного лечения поверхностных повреждений кожи, ожогов, гнойных ран. Только в России ежегодно до 600 тысяч человек получают ожоги и регистрируется более 12 млн случаев ушибов, ран, переломов костей верхних и нижних конечностей, что очень часто приводит к развитию гнойных процессов. В настоящее время для лечения гнойных ран и трофических язв начали применять фотодинамическую терапию (ФДТ).

20. Заживление огнестрельных ран у крыс при фотодинамической терапии с использованием комплексов фотодитазин-поливиниловый спирт

21. Сроки очищения ран у больных от гнойно-некротических масс, появления грануляций и краевой эпителизации

22. Динамика заживления ран в основной и контрольной группах.

23. . Сроки полного заживления ран в основной и контрольной группах.

24. Применениекомплекса плюроник F127 - фотодитазин при лечении гнойно-некротической раны лопаточной областиВ 10 раз меньшая доза активного препарата в комплексе с полимером в 1,5-2 раза сокращает сроки закрытия ран На 2-сутки после воздействия ФД-АП и облучения (рана очистилась) Исходное состояние после некроэктомии На 14- сутки произошла эпителизация

27. Использование комплексов амфифильных полимеров с «Фотодитазином» позволит разработать высокоэффективный комплексный метод лечения ран и ожогов, основанный на совмещении ФДТ пораженных участков тела с воздействием бактерицидных факторов, что достигается при иммобилизации ФС на полимерных носителях, обладающих собственной бактерицидностью. • Этот метод при использовании простой автономной аппаратуры для фотовозбуждения ФС позволит проводить первичную обработку ран и ожогов, препятствующую дальнейшему инфицированию травм, в условиях чрезвычайных ситуаций и отсутствия специального оборудования.

28. Совершенно очевидно, что предлагаемые лекарственные формы «Фотодитазина» найдут применение при лечении воспалительных, эрозивных и неопластических процессов слизистой оболочки тканей в гинекологии, оториноларингологии и стоматологии, где достаточно широко применяются препараты в виде мазей, гелей и спреев.

29. В настоящее время рак по смертности стоит на 2-м месте после сердечно-сосудистых заболеваний. Ежегодно в России регистрируется около 500 тысяч первичных онкологических больных и около 300 тысяч смертей от рака. По данным ВОЗ в мире в 2007 году произошло 7,9 миллиона случаев смерти от рака (около 13% всех случаев смерти). • По прогнозам Международного Агентства по изучению рака к 2015 году планету захлестнет эпидемия онкологических заболеваний. Ежегодно будут регистрироваться до 15 миллионов новых случаев, и ежегодно в мире будут погибать до 10 миллионов больных. По прогнозам ВОЗ в 2020 г. число онкологических больных увеличится на 50%, несмотря на значительный прогресс в развитии методов лечения рака.

30. Одной из причин такой ситуации является отсутствие реально применимых в широкой медицинской практике методов ранней диагностики рака. Новый подход, который может быть назван ранней люминесцентной диагностикой (РЛД), направлен на выявление наиболее распространенных, визуально и эндоскопически доступных нозологических форм злокачественых новообразований.

31. Терапевтические фотосенсибилизаторы принципиально не могут использоваться для эффективной первичной диагностики рака, поскольку их люминесценция в тканях всегда сопровождается процессом эффективной генерации синглетного кислорода как в злокачественных, так и в здоровых тканях организма, что вызывает ряд нежелательных побочных реакций.

32. Предлагается создание и использование для люминесцентной диагностики рака нового класса нефототоксичных ФС, которые практически не генерируют синглетный кислород, имея при этом высокие люминесцентные характеристики при сохранении уровня туморотропности терапевтических ФС.

33. Схема электронных переходов порфириновых сенсибилизаторов и образования синглетного кислорода

34. Для большинства синтезированных порфиринов были приготовлены комплексы с платиной, палладием, родием, иттербием, неодимом и рутением. • Иттербиевые комплексы были выбраны в качестве объектов исследования в связи с тем, что для этих комплексов при возбуждении π–электронной части молекулы была обнаружена ИК- люминесценция, обусловленная переходами 2F5/2 уровня 4f электронов иона Yb3+.

35. Дикалиевая соль Yb(acac) -2,4-диметоксигематопорфиринаIX

36. Спектры люминесценции некоторых Yb-металлокомплексов порфиринов 1 - Yb(acac) –tetra-(1-N- (p-fluorophenyl)-3(о-chlorphenyl) pyrazole-4-il) porphyrin (10-6 М, 40% DMSO); 2 - Yb(acac) - 2,4-dimethoxyhematoporphyrin IX (10-6 М, 40% DMSO )

37. ИК спектры люминесценции опухолевой ткани (саркома) in vivo через 5 часов после введения Yb(acac)-2,4 –диметоксигематопорфирина IX: а-центральная часть опухоли; b- периферия; с-прилегающая здоровая кожа; d- кожа контрольной мыши ИК спектры люминесценции опухолевой ткани (саркома) -1 и мышцы контрольной мыши -2 через 27 часов после введения Yb(acac)-2,4 –диметоксигематопорфирина IX:

38. Полученные спектрально-кинетические данные позволяют рассматривать Yb-комплексы порфиринов как перспективные маркеры для люминесцентной диагностики опухолей без свойственной традиционным порфиринам фототоксичности и с высоким значением люминесцентного контраста.

39. Тераностика – развивающаяся область медицины, сочетающая в себе терапию и диагностику, когда врачи используют одну технологию и для диагностики, и для лечения заболевания в ходе общей процедуры.

40. Термотерапия Суспензия специальным образом приготовленных наночастиц вводится внутривенно в организм больного. Из-за особенности ангиогенеза в опухоли сосудистая сеть оказывается проницаемой для наночастиц размером около 100 нм. Это обеспечивает избирательное накопление нанопрепаратов в опухоли, изменение фармакокинетики и существенное снижение токсичности. После накопления нанопрепарата в опухоли патологический участок подвергается облучению в определенном спектральном диапазоне. В зависимости от параметров и режима облученияв месте локализации наночастиц в ткани может быть за короткое время достигнута высокая температура, при которой раковые клетки погибают.

41. Прохождение наночастиц через поры в эндотелииВ процессе ферментативного расщепления оболочек капилляров в эндотелии, устилающем их внутреннюю поверхность, образуются поры, размером 380 – 780 нм (в нормальных сосудах их размер не более 50 нм). Иногда размеры этих дефектов могут достигать значений до 1,2 мкм.

42. В зависимости от физических характеристик (размера, качества и толщины металлического покрытия) наночастицы способны поглощать излучение в различных областях спектра (плазмонный резонанс), что делает возможным при изготовлении композиционных наночастиц варьированием технологических параметров наилучшим образом коррелировать их спектральные характеристики со спектральными свойствами определенных биологических тканей. Таким образом появляется возможность создания композиционных нанопрепаратов адресного действия. Способность ИК излучения проникать в биологическую ткань на большую глубину (до 10 см) в зависимости от типа ткани позволяет разработать методику фототермотерапии опухолей достаточно глубокой локализации с применением адресных композиционных нанопрепаратов, что представляет нерешенную пока проблему для неинвазивной лазерной термотерапии.

43. Для проведения нанотермотерапии подыскиваются материалы, обладающие сродством к опухолевым тканям или специфическими размерами 80 – 250 нм в диаметре. Клетки человека имеют размер 10000-30000 нм в диаметре, органеллы – 2000-30 нм, макромолекулы - <5 нм. Наночастицы меньше 20 нм могут свободно проходить сквозь стенки кровеносных сосудов. Чтобы доставить лекарственный препарат непосредственно в пораженный орган и преодолеть при этом фильтрацию в селезенке и печени, размер наночастиц должен быть не более 150-200 нм и не менее 50 нм. В настоящее время установлен оптимальный размер нанопрепаратов 120-170 нм.

44. Одним из перспективных материалов для использования в нанотермотерапии являются наночастицы золота и кварца, покрытые золотом. Как известно, золото среди всех остальных металлов обладает наибольшей тропностью к опухолевым тканям. Диаметр используемых частиц обычно составляет 50 нм, однако при длительном хранении они образуют агрегаты, трудно поддающиеся механическому разделению.

45. Окно прозрачности биотканей Настройка резонансов золотыхнаносфери нанооболочек

46. Схема получения и применения нанокомпозитов

47. Обзорное (а) и увеличенные (б – в) ТЭМ изображения наночастиц и гистограмма распределения частиц по размерам (г). Показаны: сквозное отверстие и структура в центре частицы (б, стрелка), частицы различной структуры (вставки A-C), типичная толщина стенки полой наночастицы 4-5 нм (D) и средний размер кубических наночастиц 53.5 ± 5 нм (г, стрелка).

48. Фото и ТЭМ-изображения образцов

49. Доказательство функционализации Yb-HP: Флуоресцентные свойства Yb-HP +Yb-HP

50. 1 - наночастицы Au nanocages, покрытые двуокисью кремния с HP – Yb концентрация – 7 mkg/ml2 - раствор HP – Yb в воде концентрация 7 mkg/ml.