1 / 31

Dal ší techniky

Dal ší techniky. Imunologické, mikrosatelity, SSCP, SINE. Obsah. imunologické techniky Mikrosatelity a techniky příbuzné SSCP unikátní znaky. Obsah. imunologické techniky Mikrosatelity a techniky příbuzné SSCP unikátní znaky. Imunologické techniky. stanovení imunologických distancí

yana
Download Presentation

Dal ší techniky

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Další techniky Imunologické, mikrosatelity, SSCP, SINE

  2. Obsah • imunologické techniky • Mikrosatelity a techniky příbuzné • SSCP • unikátní znaky

  3. Obsah • imunologické techniky • Mikrosatelity a techniky příbuzné • SSCP • unikátní znaky

  4. Imunologické techniky • stanovení imunologických distancí • sdílení jednotlivých znaků (antigenů)

  5. Stanovení imunologických distancí • precipitace (turbidometrie či imunodifuse) • komplement fixační reakce • aglutinace • ELISA • Ria

  6. Imunodifuse

  7. Dvojitá imunodifuse

  8. Imunoelektroforéza

  9. Hemaglutinační test

  10. ELISA

  11. Využití imunologických technik • kvalitní distanční data • multilokusová (totilokusová) metoda • metodicky relativně nenáročné • umožňuje porovnávat i velmi vzdálené taxony

  12. Úskalí imunologických technik • U-závislost precipitace na koncentraci antigenu • krosreaktivita závisí nejen na podobnosti epitopů ale i na jejich koncentraci • nutnost přípravy polyklonálních protilátek

  13. Obsah • imunologické techniky • Mikrosatelity a techniky příbuzné • SSCP • unikátní znaky

  14. Mikrosatelity • mikrosatelity - (nazývané i STR - Short Tandem Repeat) jsou krátké sekvenční motivy (dinukleotidy až hexanukleotidy) vyskytující se na některých místech genomu v mnoha tandemově uspořádaných kopiích o celkové délce až 150 nukleotidů. Zpravidla existuje velmi značný vnitropopulační polymorfismus v počtech kopií daného mikrosatelitu a tento polymorfismus a mutabilitu (okolo 0,1 % mutací za generaci) můžeme snadno studovat například PCR amplifikací daného lokusu.

  15. Analýza mikrosatelitů • najít vhodný lokus (klonování a hybridizace) • připravit PCR primery ohraničující daný lokus • amplifikovat lokus • elekroforéza amplifikovaných fragmentů

  16. Mikrosatelity Analýza jednolokusového polymorfismu pomocí ptačích mikrosatelitních primerů.

  17. Využití metody • vnitrodruhové studie či příbuzné druhy • kodominance znaků – populační genetika • modernější a přesnější varianta alozymové analýzy • možno analyzovat velké množství vzorků • nákladné pouze zavedení metody pro nové organismy

  18. DNA-fingerprinting- minisatelity Restriktáza-fingerprint ptačí DNA. Genová DNA byla štěpena restrikčním enzymem, přeblotována na nylonovou membránu a hybridizována s radioaktivně značenou sondou 33.15

  19. VNTR VNTR polymorfismus v promotoru RHOB genu u člověka: 8-11 x 34 bp (amplifikováno pomocí PCR)

  20. Obsah • imunologické techniky • Mikrosatelity a techniky příbuzné • SSCP • unikátní znaky

  21. SSCP • (Single-Strand Conformation Polymorphism) - metoda identifikace polymorfismu v sekvencích DNA a RNA umožňující na molekulách v jednořetězcovém stavu (u DNA po denaturaci) detegovat pomocí polyakrylamidové elektroforézy rozdíly v elektromobilitě vyvolané jednotlivými substitučními mutacemi.

  22. _ _ _ + + + PCR denaturace renaturace vertikální elektroforéza vizualizace

  23. SSCP HLA polymorfismus sledovaný pomocí SSCP. Jednořetězcové fragmenty byly připraveny pomocí asymetrické PCR.

  24. Využití metody • obdoba sekvenčních dat • umožňuje velmi rychle a velmi levně charakterizovat velké množství vzorků • množství získané informace je srovnatelné se sekvenováním neboť většina mutací se projeví změnou pohyblivosti příslušného fragmentu (alespoň jednoho řetězce) • je vhodné charakterizovat jednotlivé varianty sekvenací

  25. Obsah • imunologické techniky • Mikrosatelity a techniky příbuzné • SSCP • unikátní znaky

  26. SINE analýza • (short interspersed repetitive elements) – retroposony derivované z tRNA, případně 7 SL RNA (Alu). Velikost: 70-500 PB. Vytvářejí značnou část eukaryotického genomu, často až 104 kopií na genom. Výhoda pro molekulární fylogenetiku existuje jen malá pravděpodobnost, že by se u dvou nepříbuzných organismů vložily do stejného místa a je téměř vyloučeno, že by se bezestopy z daného místa vystřihly.

  27. Postup • Najít nový SINE element (in vitro transkribce celkové DNA) • Naklonovat úseky genomu obsahující daný SINE (genomová knihovna) • Vytipovat SINE lokusy které jsou polymorfní u studovaného taxonu (hybridizace nebo PCR) • PCR amplifikace • Ověření absenci SINE sekvenací získaných krátkých PCR fragmentů

  28. Výsledek SINE analýzy (cichlidy) PCR produkty EtBr Hybridizace se SINE probou Hybridizace s okolní sekvencí Takahashi, Tera, Nishida, Okada (1998) Mol.Biol.Evol. 15: 391-407.

  29. Fylogeneze kopytníků a kytovců na podkladě SINE insercí

  30. Využití SINE analýzy • použitelná pro vyšší taxony (maximálně však 75-100 milionů let • málo znaků – není možno počítat délku větví • unikátní události malá pravděpodobnost homoplázií • vždy nutno ověřit absenci SINE v daném lokusu minimálně amplifikací, raději sekvenací

More Related