GEÇMİŞTEN GELECEĞE GONADOTROPİNLER VE SON TEDAVİ PROTOKOLLERİ

1. GEÇMİŞTEN GELECEĞE GONADOTROPİNLER VE SON TEDAVİ PROTOKOLLERİ DOÇ. DR. ERAY ÇALIŞKAN ÖZGÜR HEKİM

2. TARİHÇE VE GELİŞİM

3. 1910s 1920s 1950s 2000s 2010s 1930s 1960s 1970s 1980s 1990s 1940s 17th Century 18th Century 19th Century İlkIVF— Kurbağa oositi Spermatozoa görülmesi Gonadların hipofiz tarafından uyarıldığına dair ilk kanıtlar KOS için gebe at idrarı gonadotropini İlkIVF bebeği SFSs HPOaksı recFSH Klinik kullanım için ilk gonadotropinler insanPG İlk İnsan IUI İnfertilite tedavisinin gelişimi IVF = in vitro fertilization; hPG = hypothalamic-pituitary-gonadal; COS = controlled ovarian stimulation; hPG = human pituitary gonadotropins; PMSG = pregnant mare serum gonadotropin; recFSH= recombinant human follicle-stimulating hormone; SFS = sustained follicle stimulant. Clarke. Hum Reprod. 2006;21:1645; Hayden. Eur J Endocrinol. 2008;(159 suppl 1):S17; Lunenfeld. Hum Reprod Update. 2004;10:453; Macklon et al. Endocr Rev. 2006;27:170-207; Practice Committee of American Society for Reproductive Medicine, Birmingham, Alabama. Fertil Steril. 2008;90:S13.

4. Gonadotropin Teorisinin İnfertilite Tedavisinde Önem Kazanması • Aschner(1912) • Hipofizin gonad uyarısındaki rolnün kesinleşmesi • Hipofizin başka beyin merkezleri tarafından kontrol edildiğinin ileri sürülmesi • Crowe et al (1910) • Hipofizlerin overleri uyarması ile ilgili ilk deneysel kanıtlar Smith (1926) and Zondek (1926) “Gonadotropinteorisi” 17th Century 18th Century 19th Century 1910s 1950s 2000s 2010s 1920s 1930s 1960s 1970s 1980s 1990s 1940s Crowe et al. Bull Johns Hopkins Hosp. 1910;21:127; Lunenfeld. Hum Reprod Update. 2004;10:453; Practice Committee of American Society for Reproductive Medicine, Birmingham, Alabama. Fertil Steril. 2008;90:S13; Smith. Proc Soc Exp BiolMed. 1926;24:1311.

5. Gonadotropinler Neredeyse Yüzyıl Önce Bulunmuştur • 1929: Zondek • Hipofizin overi uyaran iki hormon salgıladığını iddia etmiştir • 1930: Zondek • Postmenapozal kadınların kan ve idrarında gonadotropin olduğunu gözlemlemiştir • Prolan A (FSH) • Prolan B (LH) • Gonadotropinlerinoverler üzerindeki etkilerini tanımlamıştır 17th Century 18th Century 19th Century 1910s 1950s 2000s 2010s 1920s 1930s 1960s 1970s 1980s 1990s 1940s LH = luteinizing hormone; FSH = follicle-stimulating hormone. Lunenfeld. Hum Reprod Update. 2004;10:453.

6. İnfertilite Tedavisinin Klinik Kullanımında Gonadotropin Preparatlarının Markete Çıkması 1927: Gebelerin kan ve idrarında overleri uyarıcı maddenin bulunması (hCG) 1931: Organonplasentalekstraktlardan «prolan B» isimli hipofiz hormonuna çok benzeyen bir maddeyi «overleri uyarmak için» üretmiştir 1930-1945:hCG ile klinik çalışmalar 1940:İdrardan elde edilen hCG preparatlarının kullanımı 17th Century 18th Century 19th Century 1910s 1920s 1930s 1940s 1950s 1960s 1970s 1980s 1990s 2000s 2010s hCG = human chorionic gonadotropin. Lunenfeld. Hum Reprod Update. 2004;10:453.

7. Follikül Uyarımı İçin Gonadotropin Kullanımının Fikirsel Temelleri • 1941: MazerveRavetz • Over uyarımı için gebe at idrarından üretilen gonadotropinlerin kullanımı • hCG kullanarak ovülasyonun uyarılması “ Overleringonadotropinlere cevabı overlerinreseptivitesine, total doza, tedavi süresine bağımlıdır • 1945: “Ideal Tedavi” – Hamblen et al • Folliküler fazda at idrarından elde edilen gonadotropin kullanımı ve 12-18 gün sonra hCG yapılması • Sekretuvarendometriyum oluşmasına neden olmaktadır • Planlı cinsel ilişki gebelik sağlayabilir 17th Century 18th Century 19th Century 1910s 1950s 2000s 2010s 1920s 1930s 1960s 1970s 1980s 1990s 1940s PMSG = pregnant mare serum gonadotropin; hCG = human chorionic gonadotropin. Lunenfeld. Hum Reprod Update. 2004;10:453.

8. Over Uyarılmasında Hayvan Hipofiz Ekstraktlarının Kullanımı • Hayvan hipofiz ekstraktları 1960’ların başına kadar overlerin uyarılması için kullanılmıştır • 1956: Maddocket al • Dışarıdan FSH kullanımının idrarda östrojen artışına yol açtığını bulmuştur • Bazı hastalarda 7-10 cm’ye kadar büyümüş kistler bulunmuştur • Kistlerde erken luteinizasyon değişiklikleri gösteren granüloza hücreleri gözlenmiştir • 1959: Netter et al • 1-3 ampul hayvan hipofiz ekstraktı kullanılarak idrarda inanılmaz östrojen artışları gözlenmiştir • 1959: French Sosyal Güvenlik Sistemi • Hayvan hipofiz ekstraktı kullanımını geri ödemeye almıştır 17th Century 18th Century 19th Century 1910s 1950s 2000s 2010s 1920s 1930s 1960s 1970s 1980s 1990s 1940s FSH = follicle-stimulating hormone. Lunenfeld. Hum Reprod Update. 2004;10:453.

9. Ticari olarak İnsan Hipofizi Kaynaklı Gonadotropinlerin Üretilmesi • 1958: Carl Gemzellinsan hipofiz dokusundan gonadotropin elde etmiştir • 1961: Buxton and Hermann liyofilize edilmiş insan hipofizinden alkol ile elde edilmiş FSH’yı test etmişlerdir • İnsan hipofizi kaynaklı gonadotropinlerin bulunması ve infertilitetedavisinda başarı ile kullanılması1958-1988 • İnsan hipofiz dokusundan elde edilen gonadotropinlerin market için yetersiz olduğu bulunmuş ve alternatif kaynaklar aranmaya başlanmıştır • İnsan hipofizelgonadotropinlerinin kullanımından 20 yıl sonra iatrojenikCreutzfeld–Jakobhastalığı bulunmuştur • Bu vakalar insan hipofizinden elde edilen gonadotropin kullanımı ile ilişkilendirilmiştir • Bu olguların hiçbiri lisanslı ilaç şirketi ürünleri ile ilişkilendirilememişse de insan hipofizinden elde edilen gonadotropinin kullanımı yasaklanmış ilaçları marketten çekilmiştir 17th Century 18th Century 19th Century 1910s 1950s 2000s 2010s 1920s 1930s 1960s 1970s 1980s 1990s 1940s hPG = human pituitary gonadotropins; FSH = follicle-stimulating hormone. Lunenfeld. Hum Reprod Update. 2004;10:453.

10. İnsnMenapozalGonadotropinlerinin Hipofiz Ekstraktlarının Yerine Kullanımı • Büyük idrar havuzlarından izole edilip saflaştırılmıştır • 1950: Pergonal 25 • Klink kullanım için ilk hMG • 1961: Lunenfeldet al • Gebelikle sonuçlanan ilk başarılı ovülasyon indüksiyonunu tanımlamıştır • 1953: Steelman and Pohley • hMG içinde bulunan FSH miktarını belirlemek için altın standart bir ölçüm belirlemişlerdir • 1965: hMG dozu standardize edilmiştir • IU ölçümü kullanılmaya başlanmıştır • 75 IU veya bir ampulde= 75 IU FSH + 75 IU LH 17th Century 18th Century 19th Century 1910s 1950s 2000s 2010s 1920s 1930s 1960s 1970s 1980s 1990s 1940s hMG = human menopausal gonadotropin; FSH = follicle-stimulating hormone; IU = international unit; LH = luteinizing hormone. Lunenfeld. Hum Reprod Update. 2004;10:453; Steelman and Pohley. Endocrinology. 1953;53:604.

11. İnsan MenapozalGonadotropini Kullanımı Standardize Edilmiştir 1972: Cenevre de DSÖ bilimsel toplantısında • İnfertil çiftlerin tanı ve tedavisinde yönergeler oluşturulmuştur • Hipogonadotropik kadınlarda: hMG 150 – 225 IU/gün • Anovulatuvarnormogonadotropik kadınlarda: hMG 75 – 150 IU/gün 17th Century 18th Century 19th Century 1910s 1920s 1930s 1940s 1950s 1960s 1970s 1980s 1990s 2000s 2010s WHO = World Health Organization; hMG = human menopausal gonadotropin. Lunenfeld. Hum Reprod Update. 2004;10:453; World Health Organization. World Health Organization Technical Report. 1973; Series 514.World Health Organization, Geneva.

12. Dünyada İnsan MenapozalGonadotropini Kullanımı Artmıştır • İlk idrar toplama merkezleri • Hollanda, ispanya, israil, italya • 600 kadının idrarı • Yıllık üretimde kullanılan idrar miktarı 120,000 litre • Günümüzde idrar toplama merkezleri • Avrupa, Kore, Çin, Hindistan, Güney Amerika • 600,000 kadının idrarı • Yıllık üretimde kullanılan idrar 120,000,000 litre 17th Century 18th Century 19th Century 1910s 1920s 1930s 1940s 1950s 1960s 1970s 1980s 1990s 2000s 2010s Lunenfeld. Hum Reprod Update. 2004;10:453.

13. Üriner FSH ve LH’nın ayrı ayrı üretimi • İmmünolojik tekniklerin gelişmesi ile üriner FH ve LH’nın ayrı ayrı üretilmesi mümkün olmuştur • Bu durum biyolojik olarak minimal LH aktivitesi olan saflaştırılmış FSH üretimini sağlamıştır • İmmünolojik teknolojide seçici olarak FSH bağlayan monoklonal antikorların geliştirilmesi ile hMG içinden FSH yı ayıklayabilen bir üretim doğmuştur FSH-HP • FSH-HP nın seçici FSH aktivitesi artıştır • Bu durum KOS protokollerinin gözden geçirilmesine düşük dozlu tedavilerin veya OHSS’yi önleyebilecek küçük doz artışlarının yapılabilmesini sağlamıştır 17th Century 18th Century 19th Century 1910s 1920s 1930s 1940s 1950s 1960s 1970s 1980s 1990s 2000s 2010s LH = luteinizing hormone; FSH = follicle-stimulating hormone; hMG = human menopausal gonadotropin; FSH-HP = highly purified FSH; COS = controlled ovarian stimulation. Lunenfeld. Hum Reprod Update. 2004;10:453; Practice Committee of American Society for Reproductive Medicine, Birmingham, Alabama. Fertil Steril. 2008;90:S13.

14. RecFSH: Bir sonraki gelişme • Farmakodinamik profili doğal insan FSH’sı ile benzer • FSH üretimi için memeli hücre dizileri kullanılmıştır • Çin hamsterininover hücresi dizileri • Yabancı DNA transfeksiyonu kolay • FSH için gerekli glikoprotein sentezi kapasitesi var • Vektör klonları ile transfer edilen FSH genlerini kodlayıp okuyabiliyor • LH aktivitesi yok • İzohormon profili doğal hipofiz FSH’sı ile benzer • Yabancı protein içermeyen FSH • Proteinin kaynağı üretimde takip ve tespit edilebiliyor • Dayanıklılığı yüksek • 2010: Uzun süreli FSH uyarıcısı Avrupa’da kullanım onayı almıştır ÇHO hücreleri 18th Century 19th Century 17th Century 1910s 1920s 1930s 1940s 1950s 1960s 1970s 1980s 1990s 2000s 2010s recFSH= recombinant follicle-stimulating hormone; DNA = Deoxyribonucleic acid; CHO = Chinese hamster ovary; LH = luteinizing hormone; SFS = sustained follicle stimulant. Galway et al. Endocrinology. 1990;127:93; Olijve et al. Mol Hum Reprod. 1996;2:371.

15. GnRHAgonist ve Antagonistlerinin Geliştirilip Onaylanması • 1971: GnRHizole edilmiş yapısı çözülmüştür • 1-2 amino asiti değiştirilmiş GnRHagonistleri üretilmiştir • 1978: GnRH kullanımından sonra over fonksiyonlarında geçici artış «alevlenme etkisi» bulunmuştur • 1980lerin başı: GnRHagonistleri KOS sırasında prematür LH artışını önlemede kullanılmaya başlanmıştır • 1980lerin sonu: GnRHagonistlerinin kullanımı IVF de standart olmuştur • 1999-2000: GnRHantagonistleri FDA tarafından onaylanmıştır • GnRHantagonistleriendojengonadotropinuyarımını hemen önlemekte kesildiklerinde endojen salgı hemen başlamaktadır. 17th Century 18th Century 19th Century 1910s 1950s 2000s 2010s 1920s 1930s 1960s 1970s 1980s 1990s 1940s GnRH = gonadotropin releasing hormone; LH = luteinizing hormone; COS = controlled ovarian stimulation; IVF = in vitro fertilization. Hayden. Eur J Endocrinol. 2008;159(suppl 1):S17; Macklon et al. Endocr Rev. 2006;27:170.

16. GonadotropinlerinKlink Kullanımındaki Köşe Taşları Uzun etkili FSH GnRHantagonistleri GnRHagonistleri recFSH FSH-HP u-FSH Hipofiz FSH Saflık ve Özgül Aktivite u-hMG Domuz FSH hCG PMSG 1950 1980 1995 2003 1930s 2010 CJhastalığı Güvenlik Verimlilik Etkinlik Antikorlar Lokal, sistemik reaksiyonlar PMSG = pregnant mare serum gonadotropin; FSH = follicle-stimulating hormone; hCG = human chorionic gonadotropin; u-hMG = urinary human menopausal gonadotropin; u-FSH = urinary human FSH; GnRH = gonadotropin releasing hormone; FSH-HP = highly purified FSH; recFSH = recombinant human FSH; SFS = sustained follicle stimulant. Lunenfeld. Hum Reprod Update. 2004;10:453.

17. Over Uyarılmasında Gelecek AMH/AF sayısı GnRH Agonist Uyarımı Hepsini Dondurma Implantasyon Yenidoğan sağlığı OHSS Zayıf Cevap Hasta Yükü AMH = Anti-Müllerian hormone; AFC = antral follicle count; GnRH = gonadotropin releasing hormone; OHSS = ovarian hyperstimulation syndrome. Practice Committee of Society for Assisted Reproductive Technology. Fertil Steril. 2012;97:835–842; FerrarettiHum Reprod. 2011;26:1616–1624; Andersen et al. Hum Reprod. 2009;24:1267–1287; Umranikaret al. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2013;170:299–304.

18. MOLEKÜLER YAPI VE FARMAKOLOJİ

19. Glikoprotein Hormonlar LH FSH Alfa subunitayı 92 aa hCG TSH

20. Non-kovalent bağla birleşmiş, 2 farklı amino asit zincirinden (α ve βsubunitleri) oluşan gliko-protein hormondur α ALT ÜNİTE: • 92 amino asitten oluşur ve Asn-52 ile Asn-78 amino asitlerine bağlı 2 karbohidrateki içerir

21. β ALT ÜNİTE: • 111 aminoasitten oluşur ve Asn-7 ile Asn-24 aminoasitlerine bağlı 2 karbohidrat eki içerir

22. İnsan FSH’sı nedir? • FSH molekülü farklı birçok izoform yapıda bulunur: mikroheterojenitekarbohidrat yapılarındaki farklılıktan kaynaklanır • Karbohidrat yapıları FSH’nın yarı ömrünü belirleme açısından önemlidir ve dolayısı ile de in-vivo biyolojik aktivitesini belirlemede rol oynar

23. FollikülStimulan Hormon(FSH) • Yarı ömrü 180 - 240 dakika • Sialikasidrezidüsü arttıkça, reseptör affinitesi azalır, dolaşımda daha uzun süre kalır

24. α LH β 121 aa hCG 145 aa

25. GonadotropinlerinPeptidKompozisyonu • LH ve HCG %81 oranında benzerlik gösterir • Yarı ömür LH 38-60 dakika hCG 24 saat

27. İnsan MenapozalGonadotropini

28. Human MenapozalGonadotropini • Postmenapozal kadınların idrarından elde edilir • İlk preparatlar %5 saf ve farklı oranlarda FSH, LH ve hCG içerirdi • 75 IU FSH + 75 IU LH • hMG’deki LH benzeri etki esas olarak hCG içeriğinden kaynaklanır • hCG, LH-benzeri etki gösterir

29. ÜRİNER FSH • Poliklonal antikorlar ile LH’nın uzaklaştırılması ile saf ürinerFSH • Post-menapozalkadınların idrarından elde edilir • Gonadotropinler ya antikor affinite kolonları ya da konvansiyonel kromotografi ile saflaştırılarak elde edilir

30. ÜRİNER FSH • FSH’ya spesifik monoklonal antikorlar ile yüksek oranda purifiye (HP) üriner FSH • HP-üriner FSH <0.1 IU LH <%5 üriner protein 10000 IU/mg spesifik FSH aktivitesi Subkutan uygulama Üretim serileri arası (Batch-to-batch) değişkenlikte azalma

31. Rekombinantİnsan Gonadotropinleri

32. FSH’nınmikroheterojenitesi (İzoformlar) • Protein zincirlerine bağlı karbohidrat yapıları ve bunların sialik asit içerikleri farklı izoformları oluşturur • Bu farklı formlar biyolojik yarı ömrü ve invivo aktivitedeki farklılığı belirler • Daha bazik formlar daha çabuk elimine olur ve daha düşük invivopotense sahiptir • Daha asidik formlar ise daha geç elimine olur ve daha yüksek invivopotense sahiptir

34. Mevcut 2 rekombinant preparat Follitropinalfa Follitropinbeta Her iki preparat ta FSH ile aynı Her ne kadar alfa ve beta olarak adlandırılsalar da aslında her ikisi de bir alfa ve bir beta glikoprotein zincir içerirler

35. Bu farklı glikoprotein zincirler elektrostatik ve hidrofobik kuvvetlerle non-kovalent bağ ile iki kompleks karbohidrat yapıya bağlanır • Posttranslasyonelglikolizasyon işlemi ve saflaştırma işlemleri benzer değildir ve bu durum farklı sialikasidrezidükompozisyonuna ve böylece farklı izoelektriketkinliğe yol açar • Ancak yapıdaki küçük farklılıklar klinik sonuçlar üzerine kanıtlanmış fark oluşturmamakta

37. BİYOLOJİK AKTİVİTE • Üriner kaynaklı FSH preparatlarının FSH içeriğinin aksine rekombinant FSH preparatları biolojik aktiviteleri yerine protein içeriklerine göre (µg cinsinden kütle) değerlendirilirler • FSH içeren preparatların biolojik aktivitesi üretim aşamasında klasik Steelman-Pohleyoverbioassay ile doğrulanmaktadır

39. Fill-by-IU Prosesi • Üriner preparatların hazırlanması için fazla miktarda idrar toplanması gerekli • Preparatlar farklı içeriğe ve protein kontaminasyonuna sahipler • Aktif proteinin kütle ile ölçülmesi anlamsız

40. Fill-by-IU Prosesi • Bu nedenle biyofarmasötik endüstrisinde geleneksel standardgonadotropinleri (ve diğer ürünleri) INVIVO veya INVITRO BIOASSAY YÖNTEMLERİ (Fill-by-IU) kullanarak biyopotensile ölçüp doldurmakta • Bioassay yöntemleri aktif protein miktarını üretilen spesifik biyolojik yanıtı değerlendirerek ve internationalunit (IU) cinsinden işaretleyerek ölçmekte ve uluslararası kabul edilmiş standartlara göre etiketlemektedir

41. Fill-by-IU Prosesi • Üretilen hammadde üzerindeki bioassay test sonuçları aktif proteinin ampul ve flakonlara istenilen bioaktivite miktarı ile doldurulmasına izin verir • Sonuçta, Farmakopelere göre etiketlenen etkinlik miktarı %80-125 aralığındırdaolmak zorunda

44. FİLL-BY-MASS • Hem folitropin alfa hem de beta formulasyonlarıkütle-ile-dolum (fill-by-mass) yöntemi ile değerlendirilmekte • Steelman-PohleyAssay ile 75 IU FSH = 5.0 ve 5.5 µg fill-by-massürüne denk gelmekte • Rekombinant FSH ürünler: Pen-shapeddevices Vialler halinde Tüm preparatlar liyofilize pudra olarak paketlenmiş cartridge ya da pen olarak hazırlanmış formulasyonları da mevcut