A B ÉS T SEJTEK FUNKCIONÁLIS VIZSGÁLATA

1. A B ÉS T SEJTEK FUNKCIONÁLIS VIZSGÁLATA

2. A humorális immunválasz szakaszai Aktiváció: B sejt proliferáció és differenciáció Felismerés Antitest szekréció Helper T sejtek, egyéb stimulusok Klonális expanzió Izotípus váltás Nyugvó IgM+, IgD+ érett B sejtek Aktivált B sejtek Affinitás érés Memória B sejtek

3. A T sejt válasz szakaszai Antigén felismerés Aktiváció Klonális expanzió Differenciáció Effektor funkciók Macrophagok, B sejtek, aktiválódása Fertőzött target sejtek ölése; macrophag aktiváció Lymphoid szövet Perifériás szövet

4. B sejt receptor szignál Antigén keresztköti a membrán IgG-t Tirozinfoszforilációs események PLCγ aktiváció GTP/GDP csere a Ras, Rac-on Biokémiai intermedierek IP3 Emelkedett Ca++ a citoszolban Ras-GTP Rac-GTP Aktív enzimek Ca++ függő enzimek Ser/thr kináz Transzkripciós faktorok

5. T sejt receptor komplex általi szignalizáció A TCR-mediáltszignaling kezdete PLCγ aktiváció Biokémiai intermedierek Emelkedett Ca++ a citoszolban Disztális szignál enzimek (Protein Páz)-IL2 válasz) Transzkripciós faktorok

6. A B-sejtek T-sejt függő aktivációja és a T sejtek APC általi aktivációja szinte mindegyik lépés gátolható A gátlás következményeiből következtethetünk az aktivációs folyamatok mikéntjére.

7. A sejtfunkciók gátlása a klinikai gyakorlatban - immunszuppresszió • gyulladások (bőrgyógyászat, tüdőgyógyászat, stb.) • transzplantáció • allergiás kórképek • autoimmun betegségek • Használt hatóanyagcsoportok/technikák • Kortikoszteroidok • citosztatikus anyagok (alkilálószerek (CP,klorambucil), folsavantagonisták (MTX), purin-/pirimidin-szintézisgátlói-AZA) • Nem citosztatikus hatású immunszuppresszív szerek • (cyclosporin A, tacrolimus/sirolimus, leflunomide) • citokin-receptor elleni antitestek, blokkoló citokin-elleni antitestek • Leukaferezis • Nagy dózisú iv. immunglobulin (IVIg)

8. Kortikoszteroidok Glükokortikoid R GRE (glukokortikoidrecognitionelement) (NF-κB, AP-1) PLA2 gátlása – arachidon(sav) anyagcsere gátlás csökken az IL-1, TNF-α, IL-4, és más citokinek szintézise

9. Glukokortikoszteroidok hatásai az immunrendszer elemeire

10. Kortikoszteroidokmegbízható hatás, megbízható mellékhatások Szisztémásan adott szteroidok mellékhatásai, a teljesség igénye nélkül: • Elhízás (centrális típusú) • Növekedési visszamaradás gyermekkorban • Fogékonyság fertőzésekre • Thrombosishajlam, coronariabetegség kockázata nő • Elhúzódó sebgyógyulás, fekélyek kialakulás • Gyomorfekély • Osteoporosis, asepticuscsontnecrosis, szteroidmyopathia • Hypertonia • Hirsutismus, bőr atrophia, szteroid acne • Glaucoma, cataracta • Psychés zavarok Rendszabályok:szigorú dózishatárok, alternáló adagolás, fokozatos leépítés Lokális alkalmazás: kevesebb (elhanyagolható) mellékhatás!

12. Immunfunkció gátlás • Az immunsejtek proliferációjának gátlásával is immunszuppresszió érhető el: • citosztatikumok • Tumorterápiás szerek, amik a limfociták osztódásának a gátlásához is felhasználhatóak, de némelyik igen súlyos mellékhatások árán. • alkiláló szerek (cyclophosphamid, chlorambucil) • purinbázisokhozkötödő, DNS-replikáció gátlók; hatékonyak, de súlyos mellékhatások árán, pl. szinte biztos leuko- és lymphopaenia • folsavantagonisták (methotrexát) • nukleinsav szintézis gátló, szükség esetén folsav támogatást igényel; hepatotoxikus (májenzimek időszakosan ellenőrzendők!) • purin antagonisták (6-merkaptopurin, azathioprin, mikofenolátmofetil) • purin szintézis gátlás – a T- és B-sejtek nem rendelkeznek megkerülő, „salvage” purinhasznosító útvonallal, csak de novo szintézisre képesek • pirimidinantagonisták

13. Immunofilin gátlószerek („kalcineurin inhibitorok”) Cyclosporin A – 11 aminosavas ciklopeptid (Tolypocladiuminflatum talajlakó gomba termeli) ciklofilinekhez kötődik, amelyek így nem tudják aktiválni a calcineurint, nincs NF-AT aktiváció  gátolt az interleukin szintézis (főleg T-sejt eredetű IL-2) Tacrolimus (FK506)– ciklosporin hatású, nagyméretű gyűrűs vegyület, makrolid antibiotikum(Streptomycestsukubaensis – baktérium termeli, 'Tsukubamacrolideimmunosuppressant‘) A tacrolimus előnye, hogy a bőrön át is felszívódik, így atópiásdermatitisben lokálisan használják. Sirolimus (rapamycin) Streptomyceshygroscopicus – (RapaNui avagy Easter Island - Húsvét szigetekről származó mikroba termeli)

16. Citotoxikus és blokkoló antitestek: CD3(OKT-3), CD4, CD2, CD7, CD25, HLA-DR Otelixizumab/visilizumab, alefacept (aCD2), Rövid távú tapasztalatok vannak ezzel a technikával, a korai xenogén (ált. egér) antitesteket felváltották a kiméra, majd a humanizált antitestek. Utóbbiak <5% egér eredetű komponenst tartalmaznak, így a hatásukat semlegesítő antitestválasz ritkább. További lehetőség: toxinokkal/izotóppal konjugált antitestek célzott sejtpusztításra (pl. Zevalin - ittrium-90) Anti-citokin antitestek: Anti-TNFα-antitestek RA infliximab, adalimumab szolubilis TNFα-rec. (etanercept - Enbrel)  RA, JCA (2006 óta törzsk.) anti-IL2  transzplantáció FTY720 (fingolimod) Isariasinclairii gomba termeli, a limfocita adhéziót befolyásolja az α4/β7integrinen keresztül. Hatására a limfociták száma lecsökken a keringésben és a nyirokcsomókban akkumulálódnak. (phase III clinicaltrials) Leflunomid Hatása a rapamycinhez hasonló, DMARD („diseasemodifyingantirheumaticdrug”)-ként 2005 óta törzskönyvezett RA-ban és arthritispsoriaticaban dihydroorotate dehydrogenase gátlás

17. Az antigén-specifikus T és B sejtek gyakorisága kicsi. A poliklonális T/B-sejt aktivációt kiváltó anyagok, és módszerek hasznosak lehetnek a sejtek funkcionális vizsgálatában.

18. Az immundeficienciák nagy része különböző funkcionális vizsgálatokkal mutathatók ki. Az antigénnel való aktiválás technikailag nehezen lenne kivitelezhető, mert az antigén-specifikus T- és B-sejtek gyakorisága kicsi. Poliklonális T-/B-sejt aktivációt kiváltó anyagokkal, és módszerekkel végezhető el a sejtek funkcionális vizsgálata.

19. A T- ÉS B-LIMFOCITÁK FUNKCIONÁLIS AKTIVITÁSÁNAK MÉRÉSE • A T- és B-sejtek poliklonális aktivációja a TCR vagy a BCR nem antigén-specifikus aktivációjával • lektinek (PHA, ConA) által indukált aktiváció • anti-IgM, anti-CD3 vagy anti-TCR ellenanyaggal, allogén T-sejt aktiváció • Az aktivációt követő T- és B-sejt válasz jellemzése • aktivációs markerek • intracelluláris események vizsgálata • proliferatív válasz • ellenanyag és/vagy citokin termelés (ELISA, CBA) • Az aktivált T- és B-sejtek számának meghatározása az antigén hatás után • ELISPOT • intracelluláris citokin jelölés • pentamer (vagy tetramer) technika

20. A LIMFOCITÁK POLIKLONÁLIS AKTIVÁCIÓJA LPS, LEKTINEK, PMA+IONOMYCIN JELENLÉTÉBEN T-sejt T-sejt B-sejt (egér) TLR4 Az Ionomycin a külső Ca2+ ionok beengedésével aktiválja a sejteket, szinergizálva a protein kináz C-hez kötődő PMA-val A lektinek (pl. Con A, PHA) szénhidrát kötő fehérjék. A sejtfelszíni glikozilált receptorok keresztkötésével aktiválják a sejteket. LPS a TLR4-en keresztül aktiválja a sejteket BCR vagy TCR-specifikus ellenanyagok is a megfelelő sejtek poliklonális aktivációját okozzák

21. Poliklonális B sejt aktivátorok hatásai

22. Pokeweed (PWM) (Phytolacca americana) – formerly used for coloring red wine (toxic: triterpene saponin) Chenopodiales Phytolaccaceae

23. Phytohaemagglutinin (PHA) Canavalia ensiformis – Jackbean, Sword bean

24. Concanavalin A (ConA) Phaseolus vulgaris – bean