Alvaro Moreno Junior Karina Hoshino Simone Mariko Siguematu

1. RapidDiagnosticMethod for theDetectionofDiarrheagenicEscherichiacolibyMultiplex PCRMiyukiFujioka, Kosuke Kasai, TomisatoMiura, Tatsusuke Sato and Yoshimitsu Otomo Alvaro Moreno Junior Karina Hoshino Simone Mariko Siguematu

2. INTRODUÇÃO • Escherichia coli causador de diarréia em humanos é conhecido como DEC (Diarrheagenic E. coli) e é dividido em 6 grupos: • STEC: E coli produtora de toxina Shiga • ETEC: E coli enterotoxigênica • EPEC: E coli enteropatogênica • EIEC: E coli enteroinvasiva • EAggEC: E coli enteroagregativa • DAEC: E coli que se adere difusamente

3. INTRODUÇÃO • As DECs têm mecanismos de virulência diferentes: produção de toxinas, habilidade de invasão a célula alvo. • A identificação desses 6 grupos de DECs é muito complexa, demanda tempo, tem um alto custo e os laboratórios clínicos rotineiramente utilizam apenas a sorotipagem para o teste de identificação. • Os genes relacionados a patogenicidade do DAEC ainda não foram identificados.

4. INTRODUÇÃO • Dentre as várias técnicas de identificação desenvolvidas, o mais útil é o mPCR. • Vários estudos comprovaram o seu emprego em identificação de genes alvo, genes virulentos. • Neste estudo, foi selecionado um conjunto de primers cujos amplicons poderiam ser identificados facilmente e em um tamanho adequado. • 9 genes alvo: stx 1, stx 2, eaeA, invE, aggR, STh gene, STp gene, LT gene e astA

5. INTRODUÇÃO • Até o momento não se conseguiu detectar os nove alvos e um único ensaio de mPCR. Por isso, o estudo foi realizado em dois ensaios simultâneos. • No ensaio 1, foi usado um conjunto de 5 primers (stx 1, eaeA, invE, STp gene e astA) . No ensaio 2 conjunto de 4 primers (stx 2, aggR, STh gene e LT gene). Estes dois ensaios foram realizados simultaneamente em cada um dos 2 tubos de reação.

6. MATERIAL E MÉTODOS Cepa bacteriana e modelo de preparação de DNA - Foi usado um total de 7 cepas controle (Tabela 1), todos foram incubados em Agar Kajiton a 37 °C por 20 ± 2 h e armazenado a 4 °C.

7. MATERIAL E MÉTODOS • Cepa bacteriana e modelo de preparação de DNA • Para a extração de DNA, cada controle foi crecido em 30 mL de caldo de Luria-Bertani com agitação a 37 °C overnight. • 100 µL da cultura de bactéria foi suspenso em 900 µL de tampão Tris-EDTA, fervido por 5 min e centrifugado a 10.000 x g por 5 min • O sobrenadante foi usado como o modelo positivo do gene patogênico para o mPCR.

8. MATERIAL E MÉTODOS • Primers e amplificação do PCR • Os primers usados estão listados na tabela 2. • Testou-se a progressiva incorporação dos primers correspondentes aos diferentes genes e várias combinações de temperatura de melting e concentração de primers. • Cada 25 µL da mistura de reação continha: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM HCl, 1,5 - 2,0 mM MgCl2, 2,5 mM de deoxinucleotsideo trifosfato, 1,25 U de Taq DNA polimerase, 25 – 50 µM de cada primer, e 2,5 µLde DNA modelo.

9. MATERIAL E MÉTODOS • Primers e amplificação do PCR

10. MATERIAL E MÉTODOS Primers e amplificação do PCR • Denaturação 94°C 1 min • Anelamento 55°C 1 min • Extensão 72°C 1 min • Ao final, manteve-se a 72 °C por mais 10 min. • Separação por eletroforese (100 V, 40 min.) em gel de agarose • Revelação com brometo de etídio.

11. MATERIAL E MÉTODOS • Aplicação do mPCR em isolamento clínico de E. coli • examinou-se pacientes ambulatoriais de hospitais privados entre Fevereiro de 2005 e Novembro de 2006 para: • Salmonella enterica • Shigella • Yersinia • Vibrio • Campylobacter • E. coli

12. MATERIAL E MÉTODOS • Aplicação do mPCR em isolamento clínico de E. coli • Um total de 683 E. coli, como culturas puras foram isolados em placas de ágar de sangue de carneiro 5% e sorotipadas com anti-soros O. Eles foram identificados pelo Enterotube II. • Todas as cepas foram incubadas em ágar Kajiton, guardada a 4 °C antes do ensaio de mPCR.

13. RESULTADOS • As cepas controle foram analisadas por cada conjunto de primers para detectar os genes de virulência (stx 1, stx 2, eaeA, invE, aggR, ST gene, LT gene e astA); • Com o uso de 8 primers simultaneamente não foi possível detectar alguns genes; • Dividiu-se os primers Conjunto de primers 1 (stx 1, eaeA, LT gene e astA) • Conjunto de primers 2 (stx 2, invE, aggR e ST gene)

14. RESULTADOS • O gene ST não pôde ser detectado, então o primer do gene ST foi dividido em STh gene e STp gene.

15. RESULTADOS

16. RESULTADOS • Todas as 683 amostras de pacientes com caso clínico de E.coli foram examinados por mPCR, e 51 DEC (EPEC, 21; EAggEC, 15; ETEC,9; STEC,6) e 38 E. coli positivo para astA foram detectados • 5 das cepas de DEC eram O antígeno não sorotipável (OUT) • Todas as 683 cepas de E.coli foram analisados com um teste confirmatório com os 9 primers individualmente e os resultados foram idênticos aos obtidos com o mPCR. • Os 9 genes alvos e as 7 cepas controles foram detectadas por mPCR. A especificidade foi de 100% e a sensibilidade de 104 CFU/mL para todas as cepas

17. DISCUSSÃO • Para confirmar a suspeita de DEC, é frequente usar o PCR comum. No entanto, isolar a cepa e identificá-lo entre os 5 grupos é muito trabalhoso e gasta-se muito tempo. Usando o mPCR com os 2 grupos de primers pode-se reduzir o tempo e o esforço na análise de vários fatores de virulência. • Nenhuma relação entre o sorotipo e a inclusão entre um dos 5 grupos por mPCR. Portanto, o diagnóstico apenas por sorotipagem pode ser incompleto. • Este estudo provou a praticidade do emprego de mPCR pois ele detectou facilmente 9 genes responsáveis pela virulência de 5 categorias de DEC.