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Neuroni piramidali del SNC che stanno crescendo su una matrice di glia/fibroblasti

Attività elettrica dei neuroni. Neuroni piramidali del SNC che stanno crescendo su una matrice di glia/fibroblasti.

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Neuroni piramidali del SNC che stanno crescendo su una matrice di glia/fibroblasti

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Presentation Transcript

  1. Attività elettrica dei neuroni Neuroni piramidali del SNC che stanno crescendo su una matrice di glia/fibroblasti

  2. Col metodo del “voltage clamp” la membrana viene portata ad un potenzialefisso prestabilito e si registrano le correnti necessarie a mantenerla “bloccata” (”clampata”) a quel potenziale. Voltage clamp Un amplificatore differenziale (A) inietta nella cellula una corrente Im, proporzionale alla differenza tra un potenziale di comando (applicato all’ingresso “+”) ed il potenziale di membrana Vm (applicato all’ingresso “-”) . • Due risultati utili: • Vm viene quasi portato a coincidere col potenziale di comando; • la variazione di Vm è praticamente istantanea, cosicché la corrente capacitiva (Ic=C dV/dt), anche se molto intensa, dura per un tempo brevissimo. • Da quel momento in poi verrà registrata (ad un potenziale prestabilito, che viene mantenuto costante) solo la corrente ionica

  3. amplificatore La derivazione delle correnti ioniche transmembranarie Neurone piramidale con un elettrodo di vetro attaccato per la derivazione delle correnti ioniche transmembranarie mediante la tecnica del (patch-) voltage-clamp

  4. Potenziale di membrana finale (Vm) costante 20 (mV) Corrente transmembranaria generata dal passaggio di Vm da –70 mV a +20 mV 60 Potenziale di riposo (Vr) -70 0 10 20 30 40 40 Tempo (ms) 20 Corrente ionica (nA) 0 -20 -40 -60 0 10 20 30 40 Tempo (ms) La tecnica del voltage-clamp consiste nel bloccare il potenziale di membrana ad un valore costante nel tempo e nel registrare le correnti ioniche transmembranarie generate a tale potenziale di membrana • Vantaggi del voltage-clamp: • In genere, gm = f(V,t) ma, • Vm è bloccato ad un valore costante  gm = f(t) soltanto e può essere dedotto dall’andamento della corrente ionica Ii • E’ possibile separare Ii da Ic. Infatti cm è caricata istantaneamente

  5. 20 Voltaggio (mV) -70 0 10 20 30 40 Tempo (ms) + TTX (IK) INa+IK 60 40 20 Corrente ionica (nA) 0 -20 -40 + TEA (INa) -60 0 10 20 30 40 Tempo (ms) Separazione farmacologica delle correnti IK e INa

  6. Allo stato stazionario (equilibrio) sarà: quindi, a C O Il modello della gate di H&H assume una reazione cinetica del 1o ordine tra gli stati aperto e chiuso della particella di gating b Quindi, la probabilità della particella di trovarsi nello stato aperto può essere descritta da: a (1-Po) Po b Trattandosi di una cinetica del 1o ordine, sarà: Considerazioni teoriche Studio del gating allo stato stazionario

  7. 60 50 40 30 20 10 0 140 1.0 Voltaggio (mV) -10 120 -20 -30 0.8 100 80 0.6 ) max (nA) Conduttanza (μS) -70 60 0.4 + 40 0 10 20 30 40 I(K (nA) Tempo (ms) 20 0.2 + 0 140 0.0 Corrente K -20 120 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60 Voltaggio (mV) 100 Voltaggio (mV) 80 60 40 20 0 -20 0 10 20 30 40 Tempo (ms) Voltaggio-dipendenza dei canali Kv IK=gK• (V-EK) gK =IK/(V-EK) EK=-80 mV

  8. 0 60 1 -1 40 0 30 -2 20 -1 10 I(Na) (nA) -3 0 -2 -10 -4 -20 -3 I(Na) picco (nA) -30 -5 -4 -40 -50 -5 -6 -6 -7 0 1 2 3 4 Voltaggio (mV) -7 Tempo (ms) -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 60 Voltaggio (mV) 0 0.14 -1 -70 I(Na) (nA) 0.12 -2 0 1 2 3 4 Tempo (ms) 0.10 -3 0.08 -4 Conduttanza (μS) 0.06 -5 0.04 0.02 0 1 2 3 4 0.00 Tempo (ms) -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 Voltaggio (mV) Voltaggio-dipendenza dei canali Na INa=gNa• (V-ENa) gNa =INa/(V-ENa) ENa=+50 mV

  9. 40 30 20 ) V 10 m 0 ( -10 o -20 i g -30 g a -40 t l -50 o V -60 -70 -80 -90 0 10 20 30 40 tempo (ms) 0 -200 ) A n -400 ( e t -600 n e r r -800 o C -1000 -1200 0 10 20 30 40 tempo (ms) Separazione della fase di attivazione della corrente di Na dall’inattivazione La pronasi rimuove l’inattivazione

  10. Gmax 2.5 1 2.0 ) S o t m r ( e a 1.5 p z a n e a l t 0.5 a t 1.0 u n d a n c o . b 0.5 C o r P 0 0 -80 -60 -40 -20 0 20 40 Voltaggio (mV) Come risalire dai valori di conduttanza allo stato stazionario alla probabilità di trovare una singola gate del canale aperta Grafico della conduttanza g(V) allo stato stazionario Nel caso di un canale inattivante, esso è stato ottenuto rimuovendo l’inattivazione Ipotesi: l’attivazione del canale è regolata da x gates n uguali e indipendenti. Allora, se n∞ è la probabilità di avere la singola gate n aperta allo stato stazionario, la probabilità Po di trovare il canale aperto allo stato stazionario (in assenza di inattivazione) sarà: Probabilità composta: n·n·n…. (x volte) Quindi, dai valori di Po si può risalire ai valori di n∞:

  11. 0 -20 -40 ) V m ( -60 1.2 m 1 V -80 a t r 1.0 e ) p -100 A a n ( h 0.8 a -120 e N 0 1 2 3 4 5 6 7 t a i d g 0.6 Tempo (ms) 0.5 e à t t i n l i e b 0.4 r a r o b 0.2 o C r 0.2 P 0.0 0.0 -0.2 0 -0.4 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 ) A n -0.6 ( Potenziale di condiz. (mV) a N I -0.8 -1.0 -1.2 0 1 2 3 4 5 6 7 Tempo (ms) Studio dell’inattivazione allo stato stazionario 0 mV Se si ipotizza che il processo di inattivazione sia regolato da un’unica gate (h), i valori in grafico sono proporzionali alla probabilità di trovare tale gate aperta allo stato stazionario

  12. a C O Il modello della gate di H&H assume una reazione cinetica del 1o ordine tra gli stati aperto e chiuso della particella di gating b Quindi, la probabilità della particella di trovarsi nello stato aperto può essere descritta da: a (1-Po) Po b Trattandosi di una cinetica del 1o ordine, sarà: Tempo-dipendenza del gating

  13. Allo stato stazionario (equilibrio) sarà: quindi, Risolvendo l’equazione differenziale del 1o ordine e applicando la condizione al contorno , si ottiene: Po(t) Se p particelle di gating indipendenti sono coinvolte nel gating del canale, allora il canale seguirà il seguente andamento temporale: [Po(t)]p Prob. Di Attivaz. Tempo 1/(a+b)=t rappresenta la costante di tempo dell’attivazione ed è un indice della velocità di attivazione della particella di gating.

  14. Ipotesi: quattro gates identiche Po= n∙n∙n∙n = n4 n4(t)=[n∞-(n∞-n0)∙exp(-t/τ)]4 60 Voltaggio (mV) 160 140 -70 0 10 20 30 40 120 Tempo (ms) 100 chiuso -70mV aperto +60mV 80 I(K) Ipotesi: una sola gate Po=n(t)=n∞-(n∞-n0)∙exp(-t/τ) 60 40 20 0 -20 0 10 20 30 40 Tempo (ms) 1.0 0.8 0.6 Prob. di apertura (Po) 0.4 0.2 chiuso aperto 0.0 0 10 20 30 40 Tempo (ms) Cinetica delle correnti di K+ del canale Kv I=g∙(V-E) ; gPo I(t)n(t)∙(V-E) I=g∙(V-E) ; gPo=n4I(t)n4(t)∙(V-E) 1 gate 4 gates

  15. Ipotesi: tre gates identiche Po=m3(t)=[m∞-(m∞-m0)∙exp(-t/τ)]3 20 Volt. (mV) -70 0 10 20 30 40 Tempo (ms) Chiuso -70mV Aperto +20mV Ipotesi: tre gates identiche di attivazione + una gate di inattivazione Po=m3(t)∙h(t) Chiuso -70mV Aperto +20mV Inattivato +20mV 0 -5 -10 I(Na) 1.0 -15 0.8 0.6 -20 Prob. di apertura (Po) 0.4 -25 0.2 0 10 20 30 40 0.0 Tempo (ms) 0 10 20 30 40 Tempo (ms) Cinetica delle correnti di Na+ voltaggio-dipendenti m(t) h(t) m3(t) m3*h

  16. Il gating dei canali voltaggio-dipendenti ovvero Come fa il voltaggio ad aprire i canali? Il controllo dell’attività dei canali per mezzo del voltaggio è la chiave che sta alla base dell’eccitabilità neuronale e del signalling

  17. Canali ionici voltaggio-dipendenti Famiglia di canali a 6 domini transmembrana (TM) Questa è una delle 4 (pseudo)subunità H5 Il poro è delineato da 4 subunità o pseudosubunità Ciascuna contiene 6 segmenti TM (S1-S6) e una regione H5 (loop P) I canali ionici voltaggio-dipendenti contengono sensori del voltaggio intrinseci Il segmento S4 corrisponde al sensore del voltaggio Vi appartengono: Canali voltaggio-dipendenti del Na+, Ca2+ e K+ Canali del K+ Ca2+-attivati Canali cationici attivati dall’iperpolarizzazione, ecc.

  18. X 4

  19. 2 2 5 4 4 5 Attiva la spirale Nel canale del K+ “Shaker”, ciascun segmento S4 contiene 7 residui basici regolarmente distribuiti ogni 3 aa. Canale chiuso: la 2a Arg di S4 è seppellita nel bilayer Canale aperto: la 2a Arg fuoriesce dal lato extracell., mentre il 4o e 5o residui basici si muovono dal citosol all’interno del bilayer

  20. Mutazioni in S4 Riducono il Movimento di Carica 1 2 3 4 5 6 7 IL R VI R LV R VF R IF K LS R HS K GL 4 R  K 2 R  neutral AA  q/n 0 - (e charges) -2 -4 K=lisina R=arginina

  21. Mutazioni in S4 Riducono il Movimento di Carica 1 2 3 4 5 6 7 IL R VI R LV R VF R IF K LS R HS K GL 4 R  K 2 R  neutral AA  q/n 0 - (e charges) -2 -4

  22. MacKinnon_Nature01473.pdf MacKinnon_Nature01580.pdf MacKinnon_Nature01581.pdf

  23. 1.0 0.8 0.6 Conduttanza g 0.4 0.2 0.0 -60 -40 -20 0 20 40 60 V (mV) m Confronto della voltaggio-dipendenza di gK e gNa

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