ESAME ISTOLOGICO : esame estemporaneo mediante uso del criostato biopsie mirate su tessuti e\o su organi prelievi autop

1. ESAME ISTOLOGICO : esame estemporaneo mediante uso del criostato biopsie mirate su tessuti e\o su organi prelievi autoptici ESAME CITOLOGICO : esame su versamento interstiziale esame su urine esame su striscio vaginale agoaspirato ITER DI PROCEDURA NEL LABORATORIO DI ANATOMIA PATOLOGICA • 1 FASE PROPEDEUTICA • 2 FASE PROPEDEUTICA DI LABORATORIO • 3 FASE PRE-ANALITICA • 4 FASE ANALITICA • 5 FASE POST-ANALITICA • 6 FASE INTERPRETATIVA • 7 REFERTAZIONE

2. ISTOLOGIA : richiesta esame da reparto o divisione ospedaliera interna o da medico esterno allegate notizie cliniche e patologiche circa la motivazione della richiesta di esame contestuale invio di reperto anatomico o istologico (vetrini di consulenza) esecuzione autopsia e relativi prelievi effettuata dal medico anatomo-patologo CITOLOGIA : richiesta esame da reparto o divisione ospedaliera interna o da medico esterno allegate notizie cliniche e patologiche circa la motivazione della richiesta di esame contestuale invio di campione citologico o di vetrino con striscio vaginale già eseguito dal ginecologo (preparazione ed anamnesi del paziente sottoposto ad agoaspirato in apposito ambulatorio) 1 FASE PROPEDEUTICA

3. ISTOLOGIA : ricezione biopsie e reperti classificazione e numerazione reperti su apposito registro interno annuale progressivo compilazione apposito modulo di profilo mirato riduzione reperti anatomici ad opera del medico in apposite cassettine per istologia procedura di fissazione dei tessuti in processatore automatico (autotecnico) (circa 15 h.) (accensione e preparazione del criostato negli esami estemporanei) 2 FASE PROPEDEUTICA DI LABORATORIO

4. ISTOLOGIA : inclusione in paraffina dei reperti in precedenza fissati preparazione microtomo e bagno termostatato stendi-sezioni raccolta sezioni istologiche di circa 3 µ su vetrini; loro fissazione in stufa a secco termostatata; procedimento deparaffinazione in solventi (per esame al criostato : riduzione reperto e taglio sezioni con loro immediata fissazione in metanolo) 3 FASE PRE - ANALITICA

5. ISTOLOGIA : colorazione manuale o automatizzata delle sezioni su vetrino colorazione di routine E.-E. colorazioni speciali reazioni specifiche di immuno-isto-chimica montaggio vetrini in mezzo di inclusione idoneo (colorazione esame criostato) Controllo di qualità : uso di sezioni già risultate positive in qualità di controllo positivo controlli inter-laboratorio 4 FASE ANALITICA

6. ISTOLOGIA : apposizione etichette identificative sui vetrini contenenti le sezioni colorate archiviazione in apposite rastrelliere delle cassettine per istologia contenenti le inclusioni in paraffina consegna dei vassoi contenenti i vetrini e dei moduli di profilo mirato al medico anatomo-patologo specialista archiviazione dei vetrini diagnosticati in istoteche 5 FASE POST - ANALITICA

7. ISTOLOGIA : osservazione dei vetrini al microscopio ottico interpretazione e diagnosi da parte del medico anatomo-patologo specialista refertazione su apposito modulo di profilo mirato e relativa consegna in segreteria amministrativa Controllo di qualità : lettura vetrini incrociata tra medico lettore e medico revisore lettura alla cieca inter-laboratorio 6 FASE INTERPRETATIVA

8. 7 REFERTAZIONE • refertazione su apposito modulo in segreteria amministrativa • archiviazione documentazione cartacea • inserimento su personal computer del referto in archivio informatico dedicato per singola area di interesse (istologia; citologia; immunopatologia) • archiviazione documentazione informatica • consegna del referto dalla segreteria al reparto o al medico richiedente o al paziente

9. DOPO IL PRELIEVO • -Tessuti Freschi inviati direttamente al patologo: perché e come. • -Tessuti sotto vuoto • Banche di tessuti: perché e come. Problemi connessi.

10. FISSAZIONE DEI TESSUTI • La diagnosi istopatologica, che si basa sullo studio della morfologia, richiede l’ uso di fissativi idonei a preservare nello statu quo ante migliore possibile la struttura del campione. La fissazione di un tessuto fornisce quindi una immagine statica, la quale, benché non ne rappresenti proprio le caratteristiche dell’ aspetto in vivo, deve tuttavia essere costantemente riproducibile. Requisiti fondamentali del fissativo ideale : • sicura preservazione della morfologia di base • integrità della struttura antigenica • impedimento di alterazioni biochimiche nei tessuti, per aggiunta o sottrazione di componenti chimiche • opposizione ai processi autolitici e putrefattivi.

11. Fissazione Definizione Trattamento chimico che porta alla immobilizzazione e alla stabilizzazione di componenti tessutali con minima dislocazione ed estrazione dei composti nativi La FORMA delle cellule e dei tessuti deve venir conservata il più possibile simile alla condizione vitale

12. Fissazione • Una fissazione ideale prevede: • Stabilizzazione contro modificazioni successive indotte da trattamenti susseguenti quale l’inclusione in paraffina • Simultaneità nel campione della reazione tessuto-fissativo ( rapida penetrazione e diffusione nei tessuti ) • Riproducibilità del processo di fissazione nonostante differente composizione del tessuto • Assenza di “anormali” componenti prodotti o estrazione di componenti native • Rapidità di azione ( per evitare l’insorgere di autolisi ) • Assenza di “sovra-fissazione”

13. Fissazione dei Tessuti • Molto importante è lo spessore del campione di tessuto che non deve, in genere, superare i 3 mm, onde evitare che al centro del tessuto intervengano fenomeni degenerativi prima dell’arrivo del fissativo. • Una buona fissazione, atto preliminare più importante della tecnica istologica, pena la perdita irreparabile del tessuto dipende: • - dal tipo, dal pH e dalla concentrazione del fissativo usato, - dalla osmolarità e dalle forze ioniche in atto • - dalla temperatura e dalla durata dell’intera operazione • In genere i fissativi più usati intervengono sulle proteine e sui lipidi, mentre i glicidi, specie se a basso peso molecolare, vengono solo inclusi tra le proteine fissate e possono diffondere nell’acqua.

14. Fissazione Classificazione I fissativi si dividono in due classi a seconda che agiscano per: 1) Coagulazione: denaturazione irreversibile delle proteine, con nuove stabilizzazioni tra gruppi diversi di diverse proteine che reagiscono una con l’altra formando aggregati MODIFICANO in modo irreversibile la struttura terziaria 3 Modi:  movimento termico con distruzione della struttura secondaria e terziaria (calore)  repulsione elettrostatica tra parti diverse di una stessa proteina (acidi forti, sali di metallo)  rimozione di H2O con disidratazione (etanolo) La disidratazione con etanolo può seguire la fissazione per Cross-link

15. Fissazione 2) CROSS LINKING: ovvero la formazione di legami crociati tra polipeptidi all’interno di una stessa proteina o tra proteine vicine STABILIZZANO la conformazione nativa della proteina E’ un processo ADDITIVO, più o meno sensibile Tipico di ALDEIDI, CARBODIMIDE Utile anche in ME, Istochimica

16. FISSAZIONE DEI TESSUTI Tecniche di fissazione : • per immersione, consistente nel sommergere il tessuto nel liquido fissativo, con rapporto volumetrico minimo tra fissativo e campione di 10 : 1 • per perfusione, in assoluto la migliore da un punto di vista teorico - pratico, ma limitata all’ animale da esperimento o ad organi asportati in loco e con vasi integri • per uso di vapori, secondo cui i tessuti si fissano grazie ai vapori che si liberano da una soluzione fissativa riscaldata, permettendo così una fissazione in situ (si evita in tal modo che alcune sostanze solubili possano diffondere in soluzione e disperdersi). Si usano fissativi altamente volatili come : formaldeide, glutaraldeide, acido osmico.

17. Fissazione dei Tessuti • La Formalina: • E’ il più diffuso ed usato fissativo in istopatologia, ad un valore di pH prossimo a 7.0. La formalina diviene monomerica ed idratata, una molecola di basso peso molecolare capace di penetrate rapidamente nei tessuti, con la formazione di gruppi idrossi-metile con le proteine, e con la formazione di legami di tipo metilenico tra catene polipeptidiche (cross-linking) • Formalina al 10%: formaldeide polimerizzata in soluzione • acquosa satura al 40% e successivamente diluita 1:10 • (detta anche formaldeide 4%) • Formalina salata: 100 ml di formaldeide al 40% + 9 g di NaCl + • 900 ml di H20; è una soluzione isotonica che impedisce la • coartazione ed il rigonfiamento cellulare • Formalina nel tamponata: 100 ml di formaldeide 40% + 900 ml • di H20 + 4 g di fosfato acido di sodio + 6.5 g di fosfato disodico • anidro; impedisce l’acidificazione dei tessuti (fenomeno dovuto • alla trasformazione della formaldeide in acido formico), • mantenendo il pH a 7.0.

18. Modi di Applicazione ( 1 ) • Immersione • Il campione deve essere immerso in almeno • 20 volte volume di fissativo • Ottima fissazione se: • dimensioni adeguate (< 3 mm di spessore) • minimo intervallo tra asportazione e immersione • (< 30 m ottimale) ( le cellule, tolte dall’organismo, non sono più ossigenate e muoiono in un tempo variabile)

19. Modi di Applicazione Immersione Importante il tipo di contenitore ( a bocca larga ) e le dimensioni. Importanti le indicazioni sul recipiente (non sul coperchio) Nome, data, Numero; provenienza

20. Modi di Applicazione ( 2 ) • Perfusione a circolazione chiusa in forma liquida (aldeidi) • Distanza tra vasi e cellule: max. 100 microns • Diffusione: penetrazione del fissativo e raggiungimento della adeguata concentrazione nel tessuto. • Dipende da: rapporto di diffusione del fissativo che a sua volta dipende da: • Concentrazione • Temperatura • Natura dl fissativo • Topografia del tessuto in rapporto al fissativo • Tipo di tessuto • Cross Link o coagulazione

21. Modi di Applicazione ( 3 ) Esposizione di cellule e tessuti disidratati (liofilizzati) a fissativi in forma gassosa (aldeidi) ad elevata temperatura ( 80°c ) Usata solo per applicazioni particolari in istochimica per rivelare amine biogene ( noradrenalina, serotonina, dopamina)

22. Fissazione dei Tessuti • Fissativi alcolici • Alcool etilico 95° • Alcool etilico 95° ed etere etilico anaparti • Alcool metilico • Alcool metilico ed acetone anaparti • L’alcool di per sé, per il basso potenziale di ossidazione e per la moderata capacità di penetrazione, non è un buon fissativo per istologia ( ma è meglio di niente ); determina eccessiva coartazione ed indurimento dei tessuti, denatura le proteine e coagula grossolanamente il citoplasma; pertanto si preferisce utilizzarlo in associazione con altre componenti onde ottenere un fissativo più efficace ed omogeneo. • Si è soliti ricorrere all’alcool etilico 95° o all’alcool etilico 50° in egual volume al materiale prelevato come prefissaggio in citologia.

23. Fissazione dei Tessuti • Miscele fissatrici a base di alcool: • Liquido di Serra: composto da 2 parti di alcool etilico 95° ed 1 parte di formaldeide 40% cui si aggiungono poche gocce di acido acetico glaciale • Liquido di Carnoy: costituito da 6 parti di alcool etilico 99°, 3 parti di cloroformio ed 1 parte di acido acetico glaciale • Liquido di Clarke: composto da 3 parti di alcool etilico 99° ed 1 parte di acido acetico glaciale • Formalina alcoolica di Lillie: costituita da 9 parti • di alcool etilico 99° ed 1 parte di formaldeide 40%

24. Fissazione dei Tessuti • Miscele fissatrici a base di acido picrico: • Liquido di Bouin: composto dalla miscela di 15 parti di • acido picrico in soluzione satura acquosa, 5 parti di • formaldeide 40% ed 1 parte di acido acetico glaciale • Liquido di Duboscq - Brasil: costituito da 150 ml di alcool • etilico 80°, 60 ml di formaldeide 40%, 15 ml di acido • acetico glaciale ed 1 g di acido picrico • Entrambi sono fissativi molto penetranti; tuttavia, la presenza dell’acido picrico e di quello acetico è di ostacolo • ad eventuali indagini retrospettive e di estrazione del DNA e, inoltre, scioglie facilmente la maggior parte delle calcificazioni presenti.

25. Rischi e precauzioni d’uso per i fissativi • Formaldeide : Potenziale allergenico (cancerogenicità) per inalazione e contatto. • Uso di cappe aspiranti. • Alcool : Rischio incendi • Glutaraldeide • Ac. Picrico • Sali di Mercurio • Tetrossido di Osmio • Importante: uso di armadi dedicati e quantità limitate.

26. Tempi d’uso per i fissativi • Formaldeide 4% (= Formalina 10% ) • Velocità di penetrazione = 0,5 cm in 24 • Fissazione: Tempo varia a sec. delle dim. del frammento, da 3h a 24h • Alcool etilico 95% : penetra lentamente nei tessuti freschi • Fissazione: accettabile sono in cell. isolate e frammenti piccoli ( diam 1-2 mm)

27. INCLUSIONE DEI TESSUTI Tecnica di inclusione in paraffina : • Si effettua di routine su campioni privi di problemi particolari, tenendo presente che, con essa, si rendono solubili e si asportano dai tessuti i grassi. • La paraffina (a punto di fusione di 58 - 60 °C) è chimicamente inattiva e conserva bene i tessuti che devono essere disidratati con immersione in alcool etilico (70°, 95° 99°) e diafanizzati con solventi della paraffina (cloroformio, benzene, toluene, xilene) prima di venire impregnati in essa e successivamente inclusi in blocchetti. • In genere, il processo di inclusione avviene mediante l’ uso di inclusoriautomatici, fatti funzionare in ore notturne, e di dispensatori di paraffina, utilizzati per ottenere dei blocchetti ben compatti che contengono il tessuto pronto per essere sezionato con gli appositi microtomi.

28. Disidratazione ETANOLO METANOLO ACETONE PROPANEDIOLO Chiarificazione XILOLO BENZOLO CLOROFORMIO

29. Inclusione Paraffina Gelatina / Agar Celloidina Resine • Idrosolubili • (Metacrilati) • Epossidiche

30. METODO IDEALE FREON ISOPENTANO Congelamento dei tessuti • Sostanze “Protettive” • Glicerolo / DMSO • Effetti del congelamento • Metodi di congelamento • Blocchi di metallo • Produzione di “Neve CO2” • Ghiaccio secco • Appar. Termo-elettrici • Gas liquidi (N2) Conservazione di tessuti e cellule

31. METODI RAPIDI MetodoT (°C) Efficienza a Fluido organico In gas liquido (N2) Il più veloce - 196 Tessuti in liquidi refrigerati a Fluido organico In ghiaccio secco Liquido organico Ottimale per la maggior parte delle applicazioni in M.O - 79 b Raffreddamento Termo-elettrico Tessuti in contatto di metalli refrigerati - 40 scarsa Supporto metallico Raffreddato per conduzione scarsa - 30 a: N-esano, isopentano, miscele di butano e pentano b: giaccio secco in miscela con etanolo, metanolo o acetone

32. Sezionamento • Microtomo • Criostato • Ultra-microtomia M.E. • Temp. ideali per i vari • tipi di tessuto • Lama • Tratt. delle sezioni • 1) Essicamento (+ fissazione) • 2) Freeze drying o altri metodi Rischio ambientale

33. Freeze – Drying (Liofilizzazione) • Principi • Applicazione ai tessuti • Trattamento successivo • Condiz. di congelamento • Condiz. di liofilizzazione • Temp. Tempo • Trappola di N2O Inclusione in paraffina Fissazione in vapori Freeze – Sobstitution

34. Tecnica di preparazione delle sezioni in paraffina, di circa 3 µ, per essere colorate : E’ un procedimento atto ad assicurare che la paraffina, non miscibile con acqua ed alcool, venga eliminata ed il tessuto possa essere impregnato dal colorante. Quindi è necessario utilizzare dei solventi della paraffina ed idratare gradualmente il tessuto sino all’ H2O distillata. Nel caso in cui il colorante sia in soluzione alcoolica ci si arresta all’ alcool 95°. xilolo 5 ’ xilolo 5 ’ xilolo 5 ’ etanolo 100° 5 ’ etanolo 100° 5 ’ etanolo 100° 5 ’ etanolo 95° 5 ’ etanolo 70° 5 ’ etanolo 50° 5 ’ H2O distillata ––› ––›colorazione SPARAFFINATURA DELLE SEZIONI

35. Composizione(Gruppi reattivi –SO4 / = PO4 / - COOH / - O / - S/ -NH3) • Tipo di colorante / pH / Solventi / Additivi • Tipo di legame Colorazione dei tessuti • Ionico (Salino – elettrostatico) • Covalenti (tra non metalli = elettroni • condivisi tra due atomi) • Complessi es. gruppi aldeidici R. Schiff • (atomo centrale con 1 o 2 legami) • es Ag. Diammina • Intermolecolari (van der Waal) tra colorante e tessuto

36. Colorazione dei tessuti • Colorazione di macromolecole sulla base di cariche (ioniche) • Componenti tissutali • Coloranti • Basofile • Acidofile • Neutrofile • Cationici (basici) • Anionici (acidi)

37. COLORANTI : DEFINIZIONE CROMOGENO ( Luce visibile 400-800 mm) Criteri di purezza Spettro Gruppi cromofori -N  -N azo c=c alkene N = O nitroso c=o oxo N - O2 nitro (gruppi auxocromi) es: -SH NOMENCLATURA coloranti NITRO AZO CHINONICI

38. Pratica di colorazione dei tessuti Technical quality Purified / Pure / Very pure Analytical grade Reattivi Purezza Acqua Etichetta sui reattivi Conservazione Scarto / Scaricamento

39. Coloranti (Assorbimento colore osservato) Coloranti cationici Nuclei / Batteri pH 3-4 per la completa ionizzazione di gruppi di fosfato DNA / RNA (selettivo) es. col. GRAM Effetto di diversi fissativi / Concentrazione di sali ZIEL-NIELSEN + Cresyl-violetto + I2 - col. Rosso = Fucsina

40. progressive - Differenziazione Ematossiline regressive - pH COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche) • EMATEINA ossidazione di ematossilina • Compl. con AL EMALLUME (Mayer - Carazzi) • Fe EMAT. HARRIS - Lillie

41. Colorazione dei tessuti Deboli Medi Forti H2O2 / I2 Ac. Perform. Permanganato • Ossidazione - Ossidanti • Riduzione • Acilazione / Alchilazione (form. di derivati acidi) • Saponificazione (idrolisi di derivati acidi • Deaminazione Reazione di Blocco

42. sezioni in H2O distillata Emallume acido di Mayer, filtrato, 7’ lavare H2O di fonte 10’ soluzione satura Li2CO3 15” lavare H2O di fonte 10’ Eosina [0.25 %], acidificata con qualche goccia di CH3COOH 1’ lavare in H2O distillata 2’ disidratare in etanolo 95° 4’ disidratare in etanolo 100° 4’ (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada) COLORAZIONE DI ROUTINE IN ISTOLOGIA Ematossilina - Eosina Risultati : nucleo blu scuro; citoplasma rosso

43. Colorazione con coloranti basici La colorabilità dipende da vari fattori: • pH • disidratazione • fissazione • temperatura

44. Colorazione con coloranti basici • pH della soluzione • Tipo di colorante • Tempo e temperatura • Tampone • Trattamento dopola colorazione Dipende da: • Aggregati di coloranti legati a gruppi acidi • Legame ionico + f. van der Waal es. Blu di Toluidina Meccanismo: + - Visibile U.V. Alcool resist. Metacromasia

48. PAS H C OH H C OH H C H C O