Luun aineenvaihdunta ja sen biokemialliset merkkiaineet

1. Luun aineenvaihdunta ja sen biokemialliset merkkiaineet Suomen Menopaussiyhdistys ja FBS Syyskoulutuspäivä 27.10.2006 Riitta Tähtelä Sairaalakemisti, FT Mehiläinen Oy Laboratoriopalvelut

2. Luun koostumus • orgaaninen väliaine – 1/3 luusta • 90 % tyypin I kollageenia • luun rakenteellinen perusta • osteoblastit syntetisoivat tyypin I prokollageenina • ristisidosten muodostuminen yhden molekyylin telopepti-dialueen ja viereisen molekyylin helikaalisen alueen välille stabiloi kollageenirakenteen

3. Luun koostumus • orgaaninen väliaine • suuri joukko ei-kollageenisia proteiineja • proteoglykaaneja, glykoproteiineja, Arg-Gly-Asp (RGD)-adheesioproteiineja, gla-proteiineja jne • entsyymiproteiineja ja niiden inhibiittoreita • kasvutekijöitä ja sytokiinejä (BMP:t, TGFb:t, FGF:t, IGF:t, PDGF, VEGF, IL-1, IL-6, IL-11 jne) • arakidonihapon metaboliitteja (PGE2)

4. Luun solut • osteoblastilinjan solut– mesenkyymikantasolusta • osteoblastit • kuutiomaisia, polarisoituneita soluja • syntetisoivat luun väliaineen proteiinit, mukaanlukien kasvutekijät ja sytokiinit • osteosyytit • lukumäärältään suurin ryhmä luusoluja, tähtimäisiä, muodostuvat osteoblasteista • tehtävä luun uudismuodostuksen säätelyssä • tunnistavat mekaanisen stressin, välittävät signaalin muille luusoluille • reunasolut • tehtävä uudismuodostusyklin aloittamisessa

5. Luun solut • osteoklastit – hematopoeettinen kantasolu • monitumaisia, aktiivisella solulla poimureuna • tuottavat entsyymejä, jotka tekevät hajotettavan luun happamaksi, mineraali liukenee • tuottavat proteolyyttisiä entsyymejä, jotka hajottavat orgaanista väliainetta (katepsiini K, MMP:t)

6. Luun solut

7. Luun uudismuodostus • luun uudismuodostusta tapahtuu koko elämän ajan • kontrolloitu luun hajoaminen yhdistyneenä kontrolloituun luun muodostumiseen • uudismuodostus tapahtuu luun uudismuodostusyksiköissä (BRU) = luun monisoluisissa yksiköissä (BMU) = osteoneissa • n 25 % hohkaluusta ja 3 % kuoriluusta uusiutuu vuosittain

8. Luun uudismuodostus osteoclast recruitment reversal quiescence resorption formation, early formation, late mineralization quiescence Hohkaluussa sykli kestää n. 3 kk, josta hajoaminen n. 2 viikkoa, kuoriluussa 4-5 kk

9. Luun uudismuodostuksen säätely • systeemihormonit • PTH, D-vitamiini, kalsitoniini, estrogeeni ym. • mekaaninen stressi • vaikutuksen välittäjinä paikalliset tekijä • kasvutekijät • sytokiinit • arakidonihappojohdannaiset (PGE2) • säätely tapahtuu suureksi osaksi osteoblastireseptoreiden kautta • muutos säätelevissä tekijöissä  tasapaino hajoamisen ja muodostuksen välillä järkkyy, useimmiten hajoaminen > muodostus

10. Luun muodostuksen merkkiaineet • osteoblastien eri kehitysvaiheissaan muodostamia proteiineja

11. PINP 35 kDa 2 proa1(I), 14250 1 proa2(I), 5500 fosforyloitunut osittain globulaarinen, osittain helikaalinen verenkierrossa kaksi muotoa, intakti PINP ja Col1 fragmentti PINPint poistuu kierrosta maksan endoteelisolujen scavenger reseptoreiden kautta PINPint RIA, PINPtot EIA tai automatisoituECLIA PICP 100 kDa 2 proa1(I), 33000 1 pro2(I), 33000 glykosyloitunut (runsaasti mannosia) globulaarinen kierrossa yksi muoto poistuu kierrosta maksan endoteelisolujen mannoosi reseptoreiden kautta, joita hormonit ja kasvutekijät stimuloivat EIA Tyypin I prokollageenin propeptidit

12. Tyypin I prokollageenin propeptidit vapautuu verenkiertoon ekvimolaarisessa suhteessa, massasuhde PICP/PINP n.3

13. Luuspesifinen alkalinen fosfataasi, Bone ALP • glykosyloitunut membraaniproteiini, verenkierrossa dimeerinä (130 kDa) • yksi luu/maksa/munuais-AFOS-isoentsyymin isoformeista (kudosepäspesifisen geenin tuotteita) • kaksi luuisoformia (B1 ja B2), joiden suhteellinen osuus muuttuu kasvun aikana, joissakin patologisissa tiloissa • verenkierrossapääasiassa luu- ja maksaisoformeja • poistuu kierrosta maksan endoteelisolujen galaktoosireseptoreiden kautta • useita määritysmenetelmiä • esikäsittelyt + elektroforeesi, HPLC • lektiinisaostus ja immunologiset menetelmät • mittaavat pääasiassa B2-muotoa, immunomenetelmillä ristireaktio maksan isoformiin (10 – 20%)

14. Osteokalsiini, OC • ei-kollageeniproteiini, 49 aminohappotähdettä, 5 700 Da • 3 glutamiinihappotähdettä g-karboksyloituu K-vitamiina vaativassa reaktiossa => bone Gla protein (= BGP) • 1,25(OH)2 D stimuloi synteesiä, sitoutuu hydroksiapatiittiin • pääasiassa osteoblastien tuottamaa mineralisaatiovaiheessa, mutta myös osteosyytit syntetisoivat OC:a – luu- ja dentiinispesifinen • osa vastasyntetisoituneesta osteoblastituotteesta vapautuu verenkiertoon, mutta OC:a vapautuu sinne myös luun hajoamisesta => heijastaa luun turnoveria • verenkierrossa useita OC-molekyylimuotoja: intaktia OC, N-Mid-fragmenttia (1-43) ja useita pienempiä fragmentteja • lukuisia kaupallisia ja inhousemetodoja (RIA, IRMA, EIA, ILMA, automatisoidut) vuodesta 1980 lähtien, tunnistavat eri tavoin OC:n eri molekyylimuotoja

15. Luun hajoamisen merkkiaineet • useita tyypin I kollageenin hajoamistuotteita, joita voidaan mitata joko virtsasta ja/tai seerumista • virtsaan erittyvät • vapaa DPD ja Pyr, (deoksi)pyridinoliiniristisidos • NTX, aminoterminaalinen ristisidottu telopeptidi • CTXbjaCTXa, peptidi karboksiterminaalisen telopeptidialueen ristisidoskohdasta • seerumista mitattavat • CTX-MMP = ICTP:n, trivalentti ristisidottu C-terminaalinen telopeptidi • CTXb ja NTX

16. Katepsiini K:n hajottamasta tyypin I kollageenista muodostuvat hajoamistuotteet NTX ja CTX • CTX antigeeni • Asp-Gly isomeeriset muodot CTXa ja CTXb • U-määritys CTXbEIAlla, CTXa RIAlla • S-CTXb-määritys EIAlla tai ECLIAlla • NTX antigeeni – tyypillinen luun tyypín I kollageenille • trivalenttinen ristisidos • U-määritys EIA- tai LIA menetelmällä • S-määritys EIAlla

17. Matriksin metalloproteinaasien hajottamasta tyypin I kollageenista muodostuva hajoamistuote ICTP = CTX-MMP Sassi & al. Bone 2000 • antigeenissa trivalenttinen ristisidos (Pyr, DPD) ja kahden 1-telopeptidiketjun runsaasti fenyylialaniinia sisältävä alue • katepsiini K hajottaa antigeenin • patologisen luun hajoamisen merkkiaine • määritys RIAlla

18. Luun hajoamisen merkkiaineet • tartraattiresistentti hapan fosfataasi (HFOStr, TRACP) • osteoklastien biomerkkiaine TRACP isoformi 5b, ilmentyy varhaisessa osteoklastikehitysvaiheessa • kokonais-TRACP (HFOStr)-aktiivisuus epäspesifinen • BoneTRAP-menetelmä mittaa spesifisesti osteoklastien TRACP5b:n aktiivisuuden immunouuton jälkeen • TRACP 5bheijastaa osteoklastien (myös varhaisten) lukumäärää, ei niiden aktiivisuutta

19. Merkkiaineet terveessä väestössä • pitoisuudet ovat ikäriippuvaiset • korkeat syntymän jälkeen, laskevat ensimmäisten kuukausien aikana • suhteellisen stabiilit lapsuudessa (>3 x aikuisten arvot) • puberteetissa • korreloivat puberteetin vaiheeseen (PINP ja ICTP) • kohoavat pojilla korkeammiksi kuin tytöillä (poikkeus U-DPD) • laskevat aikuisten tasolle 16 – 20 v tytöillä, 20 - 25 v pojilla • aikuisilla miesten arvot > premenopausaalisten naisten arvot • postmenopausaalisilla useimpien merkkiaineiden pitoisuudet kohoavat • vanhemmilla miehillä pitoisuudet pyrkivät laskemaan

20. Merkkiaineet terveessä väestössä • erittyvien peptidiristisidosten (NTX) määrän suhde erittyviin vapaisiin ristisidoksiin (DPDf) muuttuu iän funktiona • korkea turnover – suhteelliseti vähemmän vapaita ristisidoksia

21. Preanalyyttiset tekijät, tulosten tulkinta • yksilönsisäinen variaatio CVi • vuorokausivaihtelu (tyypin I kollageenimerkkiaineet, OC) • vuodenaikavaihtelu – talvella korkeampia • kuukautiskierto –luteaalivaiheessa muodostusmerkkiaineet kohoavat, hajoamisen merkkiaineet pienenevät • viitearvot aamunäytteille, U-merkkiaineet 2 h aamuvirtsanäytteestä • syöminen vaikuttaa eri merkkiaineisiin eri tavoin • vaikuttaa suuresti U,S-CTX:iin • ei juurikaan vaikuta S-TRACP 5b, S-PINP, S-Bone ALP • merkkiaineiden in vitro stabiilisuus • S-PINP, S-BoneALP, S-ICTP stabiileja • S-Osteoca, S-TRACP 5b, S-CTXb epästabiileja

22. Merkkiaineiden vuorokausivaihtelu ICTP, % of lowest

23. Merkkiaineiden kliininen käyttöarvo?

24. Merkkiaineet osteoporoosin diagnostiikassa? • varhaisessa menopaussissa olevan väestön merkkiainepitoisuuksien keskiarvot nousevat • hajoamisen merkkiaineet 20 – 70 % • eniten U-NTX, S-CTXb • muodostumisen merkkiaineet 20 – 50 % • kohonneita pitoisuuksia postmenopausaalisilla • hajoamisen merkkiaineet 15 – 70 %:lla • muodostumisen merkkiaineet 25 – 50 %:lla • osteopenisilla henkilöillä hajoamisen merkkiaineet ovat kohonneet 50 – 80 %:lla, muodostumisen merkkiaineet vain harvoilla

25. Merkkiaineet apuna osteoporoosin diagnostiikassa Garnero & al J Clin Endocrinol Metab 1994

26. Merkkiaineet apuna kiinteiden tuumorien luumetastaasien diagnostiikassa • myelooman lyyttisessä luutaudissa merkkiaineet kuten lyyttisissä metastaaseissa

27. Merkkiaineet postmenopausaalisen osteoporoosin ennustetekijöinä ? • varhaisessa menopaussissa mitatut merkkiainepitoisuudet ennustavat murtumia • kohonnut NTX- tai CTXb-eritys/-pitoisuus = lisääntynyt resorptio  luumassa vähenee  luun lujuus vähenee  luun mikrorakenne häiriintyy  murtuma • kohonnut resorptiomerkkiaine-eritys/pitoisuus  1.5 – 2.5 x murtumariski • kohonnut resorptiomerkkiaine + alentunut BMD  4 – 5 x murtumariski

28. Merkkiaineet lääkehoitojen / sairauksien luuvaikutusten seurannassa • tulehduksellisissa sairauksissa (RA, astma, IBD) luun muodostus ja hajoaminen epätasapainossa jo ennen hoidon aloittamista • hajoamisen merkkiaineet kohonneet/normaalit, muodostumisen merkkiaineet normaalit tai alentuneet – etenkin OC usein alentunut • glukokortikoidit • alentavat edelleen luun muodostusta, OC, PICP ja PINP laskevat • vaikutus luun hajoamiseen ei yhtä selvä • hajoamisen merkkiaineet voivat nousta, pysyä muuttumattomina tai laskea

29. Merkkiaineet lääkehoitojen / sairauksien luuvaikutusten seurannassa Tyroksiinihoidon aikana ** * * *** Toivonen, Tähtelä et al. Eur J Endokrinol 1998

30. Merkkiaineet luun hajoamista estävän hoidon seurannassa • merkkiaine laskee merkitsevästi 1-3 kk kuluttua tehokkaan hoidon aloittamisesta (lasku tasaantuu 3-6 kk:ssa), BMD 1-2 v kuluttua • hoidon tehokkuus • potilaan hoitomyöntyvyys • hoidon tavoitteena on merkkiainepitoisuuden laskeminen premenopausaalisten viitealueelle • lisäksi • varhainen merkkiainemuutos (3 – 6 kk hoidon aloittamisesta) ennustaa BMD-muutoksen 1-2 v hoidon aloittamisesta • varhainen luun muodostuksen merkkiaineen aleneminen on ennusteellinen myöhemmälle murtumariskin pienenemiselle • hoitoina raloksifeeni, risedronaatti tai aledronaatti

31. Merkkiaineet antiresorptiivisen hoidon seurannassa Garnero & al J Clin Endocrinol Metab 1994

32. Merkkiaineresponssi vaihtelee hoidosta riippuen Merkkiaineresponssi HRT:lle (%-muutos arvosta ennen hoidon aloittamista) Halleen & al J Bone Miner Res 2000

33. Merkkiaineresponssi vaihtelee hoidosta riippuen Merkkiaineresponssi (%) alendronaatille Hannon & al Bone 2004

34. Merkkiaineresponssi vaihtelee hoidosta riippuen Merkkiaineresponssi (%) oraaliselle klodronaatille Tähtelä et al Osteopor Int 2005

35. Merkkiaineresponssi vaihtelee hoidosta riippuen Merkkiaineresponssi bisfosfonaatille ja ERT:lle • osteoporoosin hoito pamidronaatilla tai estrogeenilla • virtsamerkkiaineet DPDf NTX CTX Garnero et al 1995

36. Pienin merkitsevä muutos = LSC

37. Pienin merkitsevä muutos (LSC) ja hoitoon vastaavien määrä Hoitona klodronaatti % resp. 39.7 34.4 55.2 40.0 72.4 79.3 Tähtelä et al Osteopor Int 2005

38. Pienin merkitsevä muutos (LSC) ja hoitoon vastaavien määrä Välimäki, Tähtelä Clin Chem 2005

39. Merkkiaineet luun muodostusta lisäävän hoidon seurannassa • S-Bone-ALP, mg/l • absoluuttiarvon nousu • ero hoito- ja lumeryhmän välillä 8% 3 kk:n aikapisteessä • S-CTX, pmol/l • absoluuttiarvon muutos • ero hoito- ja lumeryhmän välillä 12% 3 kk:n aikapisteessä Mukaeltu Meunier PJ & al. NEJM 2004

40. Merkkiaineet luun muodostusta lisäävän hoidon seurannassa • teriparatidi 20 mg/p, n = 68 • TPTD + raloksifeeni 60 mg/p, n = 69 • tutkimuksen kesto 6 kk J Bone Miner Res 2005

41. Yhteenveto • luumetabolian biokemialliset merkkiaineiden käyttö • diagnostisena apuna sekä hyvänlaatuisissa että maligniteetteihin liittyvissä luusairauksissa • lääkehoitojen ja sairauksien luuvaikutusten seurannassa • BMD-muutoksen ja murtumariskin ennustajina • suurin käyttöarvo • hoidon seurannassa • hoitovasteen varhainen toteaminen (3-6 kk) • hoitomyöntyvyys

42. Yhteenveto • merkkiaineen diagnostinen käyttöarvo riippuu luusairauden taustasta • hoitovasteen suuruus riippuu hoidon vaikutusmekanismista • hoitovasteen seurannassa näytteet samoissa olosuhteissa eri kerroilla • S-PINP sensitiivinen merkkiaine monessa tilanteessa • kasvunopeuden seuranta • luumetaboliaan haitallisesti vaikuttavan lääkehoidon seuranta • sairauksien luuvaikutusten seuranta • sekä luun hajoamista estävän että muodostusta lisäävän hoidon seuranta • ennusteellinen neoplastisessa luutaudissa