ENZIMAS

1. ENZIMAS Engª. Química Gisanara Dors Estágio de Docência

2. ENZIMAS - HISTÓRICO • Catálise biológica  início séc. XIX • digestão da carne: estômago; • digestão do amido: saliva. • Década de 50 • Louis Pasteur - concluiu que a fermentação do açúcar em álcool pela levedura era catalisada por “fermentos” = enzimas. • Eduard Buchner (1897) • extratos de levedo podiam fermentar o açúcar até álcool; • enzimas funcionavam mesmo quando removidas da célula viva.

3. ENZIMAS - HISTÓRICO • James Sumner (1926) • Isolou e cristalizou a urease; • Cristais eram de proteínas; • Postulou que “todas as enzimas são proteínas”. • John Northrop (década 30) • Cristalizou a pepsina e a tripsina bovinas; • Década de 50 – séc. XX • 75 enzimas  isoladas e cristalizadas; • Ficou evidenciado caráter protéico. • Atualmente + 2000 enzimas são conhecidas.

4. Aminoácidos: H R C* COOH NH2 ENZIMAS • Definição: • Catalisadores biológicos; • Longas cadeias de pequenas moléculas chamadas aminoácidos. • Função: • Viabilizar a atividade das células, quebrando moléculas ou juntando-as para formar novos compostos. • Com exceção de um pequeno grupo de moléculas de RNA com propriedades catalíticas, chamadas de RIBOZIMAS, todas as enzimas são PROTEÍNAS.

5. ENZIMAS – PROTEÍNA Classificação proteínas Proteínas globulares Proteínas fibrosas Estrutura das proteínas Primaria Secundaria Terciária Quaternária ENZIMAS Proteínas globulares Estrutura terciária • Proteínas com alto peso molecular, maioria entre 15 a 1000 Kilo Daltons Unit (KD) • OBS: 1 Dalton = 1 unidade de peso molecular (AMU)

6. Holoenzima Estrutura Enzimática Cofator Proteína Ribozimas Apoenzima ou Apoproteína • Pode ser: • íon inorgânico • molécula orgânica RNA Coenzima Se covalente Grupo Prostético ENZIMAS – ESTRUTURA

7. ENZIMAS – CARACTERÍSTICAS GERAIS • Apresentam alto grau de especificidade; • São produtos naturais biológicos; • Reações baratas e seguras; • São altamente eficientes, acelerando a velocidade das reações (108 a 1011 + rápida); • São econômicas, reduzindo a energia de ativação; • Não são tóxicas; • Condições favoráveis de pH, temperatura, polaridade do solvente e força iônica.

8. ENZIMAS • Comparação das enzimas com catalisadores químicos.

9. ENZIMAS – NOMENCLATURA • Século XIX - poucas enzimas identificadas - Adição do sufixo ”ASE”ao nome do substrato: *gorduras (lipo - grego) – LIPASE * amido (amylon - grego) – AMILASE - Nomes arbitrários: *Tripsina e pepsina – proteases

10. ENZIMAS – NOMENCLATURA • 1955 - Comissão de Enzimas (EC) da União Internacional de Bioquímica (IUB)  nomear e classificar. • Cada enzima  código com 4 dígitos que caracteriza o tipo de reação catalisada: • 1° dígito - classe • 2° dígito - subclasse • 3° dígito - sub-subclasse • 4° dígito - indica o substrato

11. ENZIMAS – CLASSIFICAÇÃO • Classificação das enzimas segundo a Comissão de Enzimas.

12. ENZIMAS – CLASSIFICAÇÃO • Classificação das enzimas segundo a Comissão de Enzimas.

13. ENZIMAS – CLASSIFICAÇÃO • Subclasses

14. ENZIMAS – NOMENCLATURA ATP + D-Glicose ADP + D-Glicose-6-fosfato IUB - ATP:glicose fosfotransferase E.C. 2.7.1.1 2 - classe - Transferase 7 - subclasse - Fosfotransferases 1 - sub-subclasse - Fosfotransferase que utiliza grupo hidroxila como receptor 1 - indica ser a D-glicose o receptor do grupo fosfato Nome trivial: Hexoquinase

15. Catalase Condições da Reação Energia livre de Ativação KJ/mol Kcal/mol Velocidade Relativa H2O2 O2 H2O + Sem catalisador Platina Enzima Catalase 1 2,77 x 104 6,51 x 108 75,2 18,0 48,9 11,7 23,0 5,5 ENZIMAS – CATALISADORES • Aceleram reações químicas Ex: Decomposição do H2O2

16. Catalase H2O2 O2 H2O + E+P E +S ENZIMAS – CATALISADORES • Não são consumidos na reação

17. ENZIMAS – CATALISADORES • Atuam em pequenas concentrações decompõe 5 000 000 de moléculas de H2O2 pH = 6,8 em 1 min 1 molécula de Catalase Número de renovação =n° de moléculas de substrato convertidas em produto por uma única molécula de enzima em uma dada unidade de tempo.

18. Energia de ativação sem enzima Energia Energia de ativação com enzima S Diferença entre a energia livre de S e P P Caminho da Reação ENZIMAS – CATALISADORES • Não alteram o estado de equilíbrio • Abaixam a energia de ativação; • Keq não é afetado pela enzima. • Não apresenta efeito termodinâmico global • G não é afetada pela enzima.

19. E+SESP + E ENZIMAS – COMPONENTES DA REAÇÃO Substrato se liga ao SÍTIO ATIVO da enzima

20. Ativador:Íons inorgânicos que condicionam a ação catalítica das enzimas. Fe²+ Ativador:Íons inorgânicos que condicionam a ação catalítica das enzimas. Fe²+ Porção protéica APOENZIMA Porção protéica APOENZIMA Cofator Cofator Coenzima: molécula orgânica complexa.NAD+ HOLOENZIMA HOLOENZIMA Grupamento prostético Grupamento prostético ENZIMAS – SÍTIO ATIVO • Região da molécula enzimática que participa da reação com o substrato. • Pode possuir componentes não protéicos:cofatores. • Possui aminoácidos auxiliares e de contato.

21. ENZIMAS – COFATOR • Algumas enzimas que contêm ou necessitam de elementos inorgânicos como cofatores

22. ENZIMAS – COENZIMAS • Maioria deriva de vitaminas hidrossolúveis • Classificam-se em: - transportadoras de hidrogênio - transportadoras de grupos químicos • Transportadoras de hidrogênio

23. ENZIMAS – COENZIMAS • Transportadoras de grupos químicos

24. ENZIMAS –LIGAÇÃO ENZIMA - SUBSTRATO • Emil Fischer (1894): alto grau de especificidade das enzimas originou  Chave-Fechadura , que considera que a enzima possui sitio ativo complementar ao substrato.

25. ENZIMAS –LIGAÇÃO ENZIMA - SUBSTRATO • Koshland (1958): Encaixe Induzido , enzima e o o substrato sofrem conformação para o encaixe. O substrato é distorcido para conformação exata do estado de transição.

26. ENZIMAS –ATIVIDADE ENZIMÁTICA • Enzyme Commission: “uma unidade (U) de atividade é a quantidade de enzima que catalisa a transformação de 1 micro mol de substrato ou a formação de 1 micro mol de produto por minuto”. • Expressa: U = micro moles produto/minuto Atividade específica = U/mg de proteína • Enzima pura, condições que permita a velocidade da reação seja máxima  o substrato [S] de modo a permitir que toda a enzima [E]  [ES]. V = K[E] = K[ES]

27. ENZIMAS –ATIVIDADE ENZIMÁTICA • Fatores que alteram a velocidade de reações enzimáticas: - pH; - temperatura; - concentração das enzimas; - concentração dos substratos; - presença de inibidores.

28. ENZIMAS – INFLUÊNCIA DO PH • O efeito do pH sobre a enzima deve-se às variações no estado de ionização dos componentes do sistema à medida que o pH varia. • Enzimas  grupos ionizáveis, existem em ≠ estados de ionização.

29. ENZIMAS – INFLUÊNCIA DO PH • A estabilidade de uma enzima ao pH depende: - temperatura; - força iônica; - natureza química do tampão; - concentração de íons metálicos contaminantes; - concentração de substratos ou cofatores da enzima; - concentração da enzima.

30. ENZIMAS – INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA •  temperatura dois efeitos ocorrem: • a taxa de reação aumenta, como se observa na maioria das reações químicas; • a estabilidade da proteína decresce devido a desativação térmica. • Enzima  temperatura ótima para que atinja sua atividade máxima, é a temperatura máxima na qual a enzima possui uma atividade cte. por um período de tempo.

31. ENZIMAS – INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA • O efeito da temperatura depende: - pH e a força iônica do meio; - a presença ou ausência de ligantes. • Acima desta temperatura, o  velocidade de reação devido a temperatura é compensado pela perda de atividade catalítica devido a desnaturação térmica.

32. ENZIMAS – INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA • Ea  Lei de Arrehenius • Ea pode ser determinada medindo-se a cte de velocidade da reação em ≠ temperaturas. • Curva A: gráfico usual. • Curva B: o gráfico mostra uma variação definida na inclinação, se em determinada temperatura, uma etapa ≠ se torna limitante da velocidade. • Curva C: uma queda brusca na curva indica inativação enzimática.

33. ENZIMAS – INFLUÊNCIA DA [E] • Velocidade de transformação do S em P  qtidade de E. • Desvios da linearidade ocorrem: • Presença de inibidores na solução de enzima; • Presença de substâncias tóxicas; • Presença de um ativador que dissocia a enzima; • Limitações impostas pelo método de análise. • Recomenda-se: • Enzimas com alto grau de pureza; • Substratos puros; • Métodos de análise confiável.

34. vo Vmax [S] ENZIMAS – INFLUÊNCIA DA [S] • [S] varia durante o curso da reação à medida que S é convertido em P. • Medir Vo= velocidade inicial da reação. • [E] = cte. • [S] pequenas  Vo linearmente. • [S] maiores  Vo por incrementos cada vez menores. • Vmax  [S]  Vo insignificantes. • Vmax é atingida  E estiverem na forma ES e a [E] livre é insignificante, então, E saturada com o S e V não com  de [S].

35. ENZIMAS – CINÉTICA ENZIMÁTICA • Victor Henri (1903): E + S ES • 1913 Leonor Michaelis -Enzimologista Maud Menten - Pediatra K1 Kp E + S ES E + P K-1 Etapa rápida Etapa lenta

36. ENZIMAS – CINÉTICA ENZIMÁTICA • Cinética Enzimática • Determinar as constantes de afinidade do S e dos inibidores; • Conhecer as condições ótimas da catálise; • Ajuda a elucidar os mecanismos de reação; • Determinar a função de uma determinada enzima em umarota metabólica.

37. Vmax [S] v = Vmax Km + [S] v = Vmax [S] 2 v Km v = Vmax 1 2 1- [S]  Km>>[S] 2- [S]  [S]>>Km 3- v = Vmax 3 2 Km [S] ENZIMAS – CINÉTICA ENZIMÁTICA

38. ENZIMAS – CINÉTICA ENZIMÁTICA • Afinidade da enzima ao substrato. • Km depende: • aspectos específicos do mecanismo de reação; • n° de passos da reação; • velocidades relativas dos passos individuais.

39. K1 Kp ES E + P E + S K1 K2 K-1 E + S ES K-1 K3 V E + P EP Vmax [2E] K-2 Vmax [E] [S] ENZIMAS – CINÉTICA ENZIMÁTICA • Vmax: Vmax = Kp[Et] Vmax = K3[Et]

40. v = Vmax [S] Km V [S] Enzimas – ordem da reação Quando a formação de P for proporcional à [S] a velocidade da reação é de 1a ORDEM [S]  [S] <<Km v = K[S] Quando a velocidade da reação independe da [S] a reação é de ORDEM ZERO [S]  [S]>>Km v = Vmax

41. Inclinação = 1 1 -1 1 Km [S] v Km Vmax Vmax ENZIMAS – MÉTODOS GRÁFICOS • Gráfico dos Recíprocos de Lineweaver-Burk

42. Vmax Inclinação = v -Km Vmax v Km [S] ENZIMAS – MÉTODOS GRÁFICOS • Gráfico de Eadie-Hofstee

43. Inclinação = [S] Km 1 v Vmax Vmax -Km [S] ENZIMAS – MÉTODOS GRÁFICOS • Gráfico de Hanes-Woolf

44. 2,3log[S]o Inclinação = t [S] -1/Km Vmax Vmax ([S]o-[S]) Km t ENZIMAS – MÉTODOS GRÁFICOS • Gráfico da equação integrada de Michaelis-Menten

45. INIBIDORES REVERSÍVEIS IRREVERSÍVEIS COMPETITIVOS NÃO COMPETITIVOS INCOMPETITIVOS ENZIMAS – INIBIÇÃO ENZIMÁTICA • Qualquer substância que reduz a velocidade de uma reação enzimática.

46. I compostos com estrutura molecular lembra S afinidade da enzima pelo substrato [substrato] necessária para obter a mesma [ES] ENZIMAS – INIBIÇÃO COMPETITIVA • Inibidor competitivo concorre com o S pelo sitio ativo da E livre. • I  análogo não metabolizável, derivado de um S verdadeiro, S substituto da E ou um P da reação. Km aparente da enzima

47. K1 K2 E + S ES E + P + I KI EI ENZIMAS – INIBIÇÃO COMPETITIVA Michaelis-Menten Lineweaver-Burk

48. ENZIMAS – INIBIÇÃO COMPETITIVA 1- sem inibidor 2- com inibidor na concentração [I1] 3- com inibidor na concentração [I2] > [I1]

49. I não tem semelhança estrutural com o S [substrato] não diminui a inibição Km da enzima NÃO se altera Vmax na presença do inibidor ENZIMAS – INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA • Inibidor não-competitivo se liga reversivelmente, aleatória e independentemente em um sítio que lhe é próprio.

50. + + I I ENZIMAS – INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA K2 KS E + S ES E + P KI KI KS EIS EI+ S Michaelis-Menten Lineweaver-Burk